La Giardia duodenum és un organisme paràsit que causa la giardiasi, una infecció intestinal especialment freqüent en nens petits amb signes clínics de diarrea.Anteriorment hem informat que G. duodenalis extracel·lular desencadena l'activació dels nucleòtids d'unió del receptor 3 (NLRP3) semblant a l'oligomerització intracel·lular i regula les respostes inflamatòries de l'hoste mitjançant la secreció de vesícules extracel·lulars (EV).No obstant això, els patrons moleculars exactes de l'EV duodenocòcic associat a patògens (GEV) implicats en aquest procés i el paper de l'inflamsoma NLRP3 en la giardiasi encara estan per dilucidar.
Es van construir plasmidis d'expressió eucariota recombinants pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardines en GEV, es van transfectar en macròfags peritoneals primaris de ratolí i es van detectar mesurant la molècula objectiu d'inflamació caspasa-1.Es va examinar el nivell d'expressió p20..Les giardines alfa-2 i alfa-7.3 de G. duodenalis es van identificar originalment mesurant l'inflammasoma NLRP3 (NLRP3, pro-interleucina-1 beta [IL-1β], pro-caspasa-1 i caspasa-1 p20), la secreció d'IL.nivells 1β, nivells d'oligomerització de proteïna tacada apoptòtica (ASC) i localització immunofluorescent de NLRP3 i ASC.A continuació, es va avaluar el paper de l'inflamsoma NLRP3 en la patogenicitat de G. duodenalis utilitzant ratolins en els quals es va bloquejar l'activació de NLRP3 (ratolins bloquejats NLRP3) i es van controlar els canvis patològics en el pes corporal, la càrrega parasitària duodenal i el teixit duodenal.A més, vam investigar si les hiardines alfa-2 i alfa-7.3 indueixen la secreció d'IL-1β in vivo a través de l'inflammasoma NLRP3 i vam determinar el paper d'aquestes molècules en la patogenicitat de G. duodenalis en ratolins.
Les giardines alfa-2 i alfa-7.3 indueixen l'activació de l'inflamsoma NLRP3 in vitro.Això va provocar l'activació de la p20 caspasa-1, un augment dels nivells d'expressió de proteïnes NLRP3, pro-IL-1β i pro-caspase-1, un augment significatiu de la secreció d'IL-1β, la formació de taques ASA a la citoplasma i la inducció de l'oligomerització d'ASA.Inflamació de NLRP3 La pèrdua del penis agreuja la patogenicitat de G. duodenalis en ratolins.Els ratolins tractats amb quists mitjançant sonda de ratolins bloquejats amb NLRP3 van mostrar un nombre augmentat de trofozoïts i danys greus a les vellositats duodenals, caracteritzats per criptes necròtiques amb encongit i ramificació.Els experiments in vivo han demostrat que les giardines alfa-2 i alfa-7.3 poden induir la secreció d'IL-1β a través de l'inflamsoma NLRP3, i la immunització amb giardines alfa-2 i alfa-7.3 va reduir la patogenicitat de G. duodenalis en ratolins.
En conjunt, els resultats d'aquest estudi suggereixen que la giardia alfa-2 i l'alfa-7.3 causen una regulació positiva de la inflamació NLRP3 hoste i redueixen la infectivitat de G. duodenalis en ratolins, que són objectius prometedors per prevenir la giardiasi.
Giardia duodenum és un paràsit protozou extracel·lular que viu a l'intestí prim i causa 280 milions de casos de giardiasi amb diarrea anualment, especialment entre els nens petits dels països en desenvolupament [1].Les persones s'infecten per beure aigua o aliments contaminats amb quists de M. duodenum, que després entren a l'estómac i s'excreten als sucs gàstrics.Els trofozoïts de Giardia duodenum s'uneixen a l'epiteli duodenal, causant nàusees, vòmits, diarrea, dolor abdominal i pèrdua de pes.Les persones amb immunodeficiència i fibrosi quística són susceptibles a la infecció.La infecció també es pot produir a través del sexe oral i anal [2].Els fàrmacs com el metronidazol, el tinidazol i la nitazoxanida són les opcions de tractament preferides per a les infeccions duodenals [3].Tanmateix, aquests fàrmacs de quimioteràpia causen efectes secundaris adversos com nàusees, carcinogènesi i genotoxicitat [4].Per tant, cal desenvolupar estratègies més efectives per prevenir la infecció per G. duodenalis.
Els inflamasomes són una classe de complexos proteics citosòlics que formen part de la resposta immune innata, ajudant a defensar-se de la invasió de patògens i a mediar les respostes inflamatòries [5].Entre aquests inflammasomes, s'ha estudiat àmpliament el receptor 3 d'oligomerització d'unió a nucleòtids (NOD) (NLRP3) oligomerització d'unió a nucleòtids (NLRP3) inflammasoma similar a la unió a nucleòtids perquè es pot detectar mitjançant diversos patrons moleculars associats a patògens/danys (PAMP/ DAMP), reconeix, activa el sistema immunitari innat.i regula l'homeòstasi intestinal en moltes malalties inflamatòries [6,7,8].Consisteix en el receptor de reconeixement de patrons (PRR) NLRP3, una proteïna tacada apoptòtica adaptadora (ASC) i un efector procaspasa-1 o procaspasa-11.L'inflammasoma NLRP3 actua com a hoste contra la invasió de patògens, tal com s'observa als estudis de Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] i Leishmania.[11], però també s'ha informat que l'activació de l'inflamsoma NLRP3 limita les respostes immunitàries protectores i agreuja la progressió de la malaltia, per exemple, en els cucs [12].A partir de les nostres troballes anteriors, vam informar que G. duodenalis extracel·lular desencadena l'activació intracel·lular de la inflamació de NLRP3 i modula les respostes inflamatòries de l'hoste secretant vesícules extracel·lulars (EV) [13].Tanmateix, el paper de l'inflammasoma NLRP3 en la infecció per G. duodenalis in vivo encara està per determinar.
Els Giardins es van descriure originalment com a components estructurals del citoesquelet de G. duodenalis i tenen un paper important en la motilitat del trofozoït i la fixació de cèl·lules epitelials a l'intestí prim.Per adaptar-se millor al medi i augmentar la seva patogenicitat, els trofozoïts de G. duodenalis van desenvolupar una estructura citoesquelètica única que consta de 8 flagels, 1 cos mitjà i 1 disc ventral [14].Els trofozoïts de Giardia duodenum utilitzen el seu citoesquelet per penetrar a l'intestí prim superior, especialment el duodè, i s'uneixen als enteròcits.Migren constantment i s'uneixen a les cèl·lules epitelials mitjançant el metabolisme cel·lular.Per tant, hi ha una estreta relació entre el seu citoesquelet i la virulència.Giardines específics per a Giardia duodenum són components de l'estructura del citoesquelet [15] i es divideixen en quatre classes: α-, β-, γ- i δ-giardines.Hi ha 21 membres de la família α-giardin, tots els quals tenen una capacitat dependent del calci per unir fosfolípids [16].També connecten el citoesquelet amb la membrana cel·lular.En individus amb diarrea causada per G. duodenalis, les α-giardines estan altament expressades i immunoreactives durant la infecció [17].Les vacunes heteròlogues basades en Giardia alfa-1 protegien contra la giardiasi en ratolins i són potencials antígens candidats per al desenvolupament de vacunes [18].La giardina alfa-8, localitzada a la membrana plasmàtica i els flagels, però no al disc ventral, millora la motilitat i la taxa de creixement dels trofozoïts a G. duodenalis [19].La giardina alfa-14 s'uneix a les estructures de microtúbuls dels flagels i afecta la viabilitat de G. duodenalis [20].La giardina alfa-11 està present en abundància durant tot el cicle de vida, i la sobreexpressió de la giardina alfa-11 danya el propi G. duodenalis [21].Tanmateix, no està clar si l'alfa-2 giardine i l'alfa-7.3 giardine són protectores contra la infecció per G. duodenalis i els seus mecanismes subjacents.
En aquest estudi, els plasmidis d'expressió eucariota recombinants pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine i pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine es van transfectar en macròfags peritoneals primaris del ratolí per activar NLRP3 hoste.A continuació, es van examinar els objectius d'inflamasome.També vam avaluar el paper de l'inflamsoma NLRP3 en la patogenicitat de G. duodenalis, vam investigar si les giardines alfa-2 i alfa-7,3 indueixen l'activació de l'inflamsoma NLRP3 in vivo i vam determinar que aquests dos papers de les giardines en la patogenicitat de G. duodenalis.El nostre objectiu comú era desenvolupar objectius prometedors per a la prevenció de la infecció per G. duodenalis.
Els ratolins femelles C57BL/6 de tipus salvatge (WT) d'entre 5 i 8 setmanes es van comprar al Centre d'Animals Experimentals de Liaoning Changsheng (Liaoning, Xina).Els ratolins tenien accés lliure a l'aigua, van rebre menjar esterilitzat i es van mantenir en un cicle de llum/foscor de 12/12 hores.Abans de la infecció, els ratolins van rebre antibiòtics ad libitum en aigua potable complementats amb ampicil·lina (1 mg/mL), vancomicina (1 mg/mL) i neomicina (1,4 mg/mL) (tots comprats a Xangai, Xina, organismes artificials) [22]. ].].Els ratolins que van perdre la capacitat de menjar i beure durant més de 24 hores i van perdre ≥ 20% de pes corporal van ser sacrificats humanament per luxació cervical.
Els trofozoïts de WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, EUA) es van complementar amb un 12,5% de sèrum fetal boví (FBS; Every Green, Zhejiang, Xina) i un 0,1% de bilis bovina (Sigma-Aldrich, St. Missouri, EUA). ).EUA) en condicions microaeròbiques.Els trofozoïts confluents es van recollir sobre gel i es van passar en una proporció d'1:4 per a una reproducció posterior.
Els quists de Giardia duodenum es van induir tal com es va descriure anteriorment [23], els trofozoïts es van collir en fase logarítmica i després es van diluir amb un medi que indueix l'encapsulació, pH 7, 1 (TYI-S-33 modificat) fins a una concentració final d'1 × 106 trofozoïts/mL.concentració biliar 0,05% mitjana).Els trofozoïts es van cultivar en condicions anaeròbiques a 37 ° C fins a la fase de creixement logarítmic.Canvieu el medi a medi inductor de quists (pH 7,8; ​​medi TYI-S-33 modificat amb una concentració de bilis de l'1%) i cultiu G. duodenalis a 37 ° C durant 48-96 hores, durant les quals es van observar els quists de formació al microscopi.Després que la majoria dels trofozoïts s'haguessin induït a formar quists, la barreja de cultiu es va recollir i es va tornar a suspendre en aigua desionitzada estèril per lisar els trofozoïts restants.Els quists es van comptar i es van emmagatzemar a 4 ° C per a anàlisis posteriors a través d'un tub gàstric en ratolins.
Les vesícules extracel·lulars de Giardia (GEV) es van enriquir tal com es va descriure anteriorment [13].Els trofozoïts en fase de creixement logarítmic es van tornar a suspendre en un medi TYI-S-33 modificat preparat amb FBS esgotat d'exosomes (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) fins a una concentració final d'1 × 106 paràsits/mL i es van incubar durant 12 hores.es van aïllar del sobrenedant de cultiu per centrifugació a 2000 g durant 10 min, 10.000 g durant 45 min i 100.000 g durant 60 min.Els precipitats es van dissoldre en solució salina tamponada amb fosfat (PBS), es van quantificar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) i es van emmagatzemar a -80 ° C o s'utilitzaven directament per a anàlisis posteriors.
Els macròfags peritoneals primaris del ratolí es van preparar tal com es va descriure anteriorment [24].Breument, es van injectar ratolins (de 6 a 8 setmanes) (intraperitonealment [ip]) amb 2, 5 ml de medi de tioglicol líquid Difco al 2, 98% (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) i es van alimentar 3-4 paladars.Es va recollir una suspensió de macròfags de la cavitat abdominal dels ratolins després de l'eutanàsia i es va centrifugar 3 vegades a 1000 g durant 10 min.Les cèl·lules collides es van detectar mitjançant citometria de flux mitjançant el marcador CD11b fins que la puresa cel·lular va ser > 98%, després es van afegir a plaques de cultiu cel·lular de 6 pous (4, 5 x 106 cèl·lules/pou) i es van incubar amb un 10% de FBS (Bioindustry) a 37 ° C.i 5% CO2.
L'ARN es va extreure d'1 × 107 trofozoïts en 1 ml de reactiu TRIzol (Vazyme, Nanjing, Xina), l'ADN genòmic es va extreure de l'ARN total de G. duodenalis mitjançant MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Xina) i es va sintetitzar ADN complementari (cDNA). utilitzant MonScript RTIIII Super Mix (Monad) segons les instruccions del fabricant.
La informació de la seqüència de CDS per al gen objectiu de G. duodenalis es va obtenir del NCBI GenBank.Utilitzeu Primer 5.0 per dissenyar primers de clonació sense fissures específics per a cada gen objectiu.El cebador directe (5′-3′) consta de tres parts: una seqüència superposada amb un vector linealitzat pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) i codons d'inici ATG i GNN (si la primera base no és G).Això es fa per millorar l'eficiència de l'expressió.A més, almenys 16 pb de bases combinades (contingut de GC 40–60%/Tm aprox. 55 °C).L'imprimació inversa (5′-3′) consta de dues parts, una seqüència superposada amb un vector pcDNA3.1(+) linealitzat per EcoRV (GCCGCCACTGTGCTGGAT) i una base combinada d'almenys 16 pb.(excloent les dues últimes parades).bases) un codó com AA o GA per permetre que els plasmidis recombinants expressin les seves proteïnes marcades).Les seqüències d'imprimació es mostren a la taula 1 i van ser sintetitzades per Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Xina).
Les dianes es van amplificar mitjançant l'ADN polimerasa de Pfu (Tiangen, Beijing, Xina) o Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, Xina) mitjançant l'ADNc preparat de G. duodenalis com a plantilla.El plasmidi vector d'expressió eucariota pcDNA3.1(+) es va linealitzar amb l'enzim de restricció EcoRV i es va desfosforilar mitjançant Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Els fragments linealitzats de pcDNA3.1(+) i els fragments de gens diana amplificats es van purificar mitjançant un kit de purificació de gel d'ADN (Tiangen) i es van quantificar mitjançant un Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).El fragment pcDNA3.1(+) i cada fragment de gen objectiu es van recombinar mitjançant la barreja de clonació d'assemblatge únic MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Xina) i es van confirmar mitjançant la seqüenciació d'ADN mitjançant Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Xina)..
Els plasmidis lliures d'endotoxines pcDNA3.1(+)-alfa-2 i pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 es van generar mitjançant el SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).La concentració es va mantenir per sobre de 500 ng/µl per garantir que l'EDTA del tampó d'elució no interferís amb l'assaig de transfecció.Els macròfags peritoneals primaris del ratolí es van cultivar en plaques de 6 pous amb un medi RPMI 1640 complet (Indústries Biològiques) durant 12 hores, després es van rentar les cèl·lules 3 vegades en PBS calent per eliminar la penicil·lina i l'estreptomicina i després en un medi complementat amb un medi complet.Els plasmidis lliures d'endotoxines pcDNA3.1(+)-alfa-2 i pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2,5 μg) es van diluir en 125 μl de medi sèric reduït Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..A continuació, es van diluir 5 µl de reactiu de transfecció Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) en 125 µl de medi Opti-MEM de sèrum baix.Prepareu complexos liposoma-ADN barrejant el plasmidi sense endotoxines diluït amb Lipofectamine 2000 i deixant que la mescla reposi a temperatura ambient durant 5 minuts.Transferir els complexos per separat a les cèl·lules de cada pou i barrejar lentament.Després de 4 hores, el medi de cultiu cel·lular es va substituir per 2 ml de medi RPMI 1640 complet i el cultiu es va continuar durant 24 hores.Es va afegir un medi de cultiu cel·lular fresc a les cèl·lules i es va incubar durant diversos punts de temps depenent del disseny de l'assaig.
Es van preparar mostres de proteïnes de sobrenedants i lisats cel·lulars tal com es va descriure anteriorment [25].Els paràmetres de transferència de membrana per a pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actina i His-tag eren de 200 mA/90 min.Per a la interleucina 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, EUA), caspasa-1 (p20) (Adipogen, Suïssa) i NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Suïssa) i 1:5000 dirigida a His tag (Amylet Scientific, Wuhan, Xina) i β-actina (Proteintech, Wuhan, Xina).
La reticulació amb subrat de disuccinimida (DSS) es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [26].Les cèl·lules es van rentar 3 vegades amb PBS fred i es van lisar completament amb una agulla de calibre 27 en 50 µl de tampó de reacció ASC (pH 8,0) que contenia 25 mM de Na2PO4, 187,5 mM de NaCl, 25 mM de HEPES i 125 mM de NaHCO3.La barreja es va centrifugar a 5000 g durant 3 min i el pellet es va suturar amb 10 µl de DSS (25 mM en DMSO) i 40 µl de tampó de reacció ASC durant 30 min a 37 °C.Després de la centrifugació a 5000 g durant 10 min, el pellet es va dissoldre en una solució de 40 µl de tampó de reacció ASC i 10 µl de tampó de càrrega de proteïnes 6x (TransGen, Beijing, Xina), i després la solució es va apagar a temperatura ambient durant 15 min., Després bullir 10 minuts.Les mostres de proteïnes es van sotmetre a Western blotting mitjançant anticossos anti-ASC primaris (Wanleibio, Shenyang, Xina) amb una proporció de dilució d'1:500.
Després d'un procediment descrit prèviament [13], es van recollir sobrenedants de cultiu cel·lular i es va determinar la secreció de la citocina proinflamatòria IL-1β mitjançant el kit ELISA IL-1 Beta del ratolí (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Converteix els valors de OD450nm en concentracions de proteïnes mitjançant la corba estàndard IL-1β.
Les cèl·lules recobertes de cobertors es van rentar suaument 3 vegades en PBS calent, es van fixar en un fixador de cèl·lules de teixit (Biosharp, Beijing, Xina) durant 10 minuts a temperatura ambient (RT), en 0, 1% de Triton X-Permeabilize a 100 (diluït en PBS; Biosharp). ) durant 20 minuts a temperatura ambient i bloquejar en albúmina sèrica bovina al 5% (en PBS) durant 2 hores a temperatura ambient.A continuació, les cèl·lules es van incubar durant la nit a 4 ° C amb anticossos primaris contra ASC (dilució 1:100) o NLRP3 (dilució 1:100), respectivament, i IgG anti-conill de cabra marcada amb Cy3 (H + L) (1:400; EarthOx). , San Francisco, CA, EUA) o IgG antiratolí de cabra conjugada amb FITC (1:400; Earthox) durant la nit a 37 ° C a la foscor durant 1 hora.Els nuclis es van tacar amb Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Xina) durant 5 minuts i es van observar amb un microscopi de fluorescència (Olympus Corporation, Tòquio, Japó).
Els ratolins es van dividir en quatre grups (n = 7 a cada grup): (i) Grup control negatiu tractat amb PBS (només PBS; sonda 100 µl/ratolí PBS seguit d'una injecció intraperitoneal diària de 100 µl/ratolí PBS 3 hores després)., contínuament durant 7 dies);(ii) grup control negatiu tractat amb inhibidor de MCC950 [27] (100 µl/ratolí mitjançant sonda PBS, 3 hores després, 10 mg/kg de pes corporal [BW] MCC950 [en PBS] es va administrar intraperitonealment diàriament, durada 7 dies);(iii) Grup d'infecció per quists de G. duodenalis (1,5 x 106 quists/ratolí per sonda, 3 hores després, 100 μl/ratolí de PBS intraperitoneal administrat diàriament durant 7 dies);(iv) Grup d'infecció combinada de quists de G. duodenalis Grup de tractament amb inhibidors de MCC950 (1,5 × 106 quists/ratolí per sonda, 10 mg/kg de pes corporal MCC950 intraperitonealment diari durant 7 dies a 3 h).El pes corporal de cada ratolí es va controlar diàriament i tots els ratolins van ser sacrificats el setè dia.El duodè collit (3 cm de llarg) es va tallar en trossos petits en 1 ml de PBS, els quists es van destruir durant la nit en PBS a 4 ° C i els trofozoïts de G. duodenalis.El duodè fresc (1 cm de llarg) es va aïllar per a la tinció d'hematoxilina i eosina (H&E).
Els ratolins es van dividir en dos grups: (i) grup control MOCK i (ii) grup inhibidor MCC950.Hi va haver cinc tractaments a cada grup (n = 7/grup de tractament): (i) Grup control negatiu de tractament amb PBS (només PBS; 100 µl/ratolí PBS, injecció intramuscular (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) grup control negatiu plasmidi pcDNA3.1(+) (100 µg/ADN de ratolí, mitjançant injecció intramuscular) (iii) grup control positiu d'infecció per quists de G. duodenalis (1,5 x 106 quists/ratolí, mitjançant sonda) (iv) a); grup tractat amb plasmidi pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/ADN de ratolí, per injecció intramuscular) i (v) un grup tractat amb plasmidi pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 μg/ratolí). ADN, després de 12 hores de pas, els ratolins del grup inhibidor de MCC950 van rebre una injecció intraperitoneal diària de MCC950 (10 mg/kg de pes corporal) durant 7 dies, mentre que els ratolins del grup MOCK van rebre un volum igual de tractament amb PBS. Es van fer mostres de sang. es van aïllar dels ratolins dels globus oculars i es van deixar durant la nit a 4 ° C. Les mostres de sèrum es van aïllar mitjançant un assaig d'immunosorbent lligat a enzims (ELISA) per i mesures dels nivells d'IL-1β.
Trenta-cinc ratolins es van dividir en cinc grups (n = 7/grup).El grup 1 va ser un grup de control negatiu tractat amb PBS: els ratolins van rebre 100 μl de PBS per via intramuscular i 3 dies després per sonda.El grup 2 és un grup control positiu infectat amb quists de G. duodenalis: als ratolins se'ls va injectar 100 μl de PBS, i 3 dies després es van injectar 1,5 x 106 quists/ratolí per via intragàstrica.Tercer grup: immunització plasmídica amb pcDNA3.1(+) en combinació amb un grup de control per a la infecció del quist duodenal: els ratolins van rebre 100 μg d'ADN plasmidi pcDNA3.1(+)(im) per via oral, 1,5 × 106 quistes/ratolí 3 durant diversos dies.Els grups 4 i 5 eren plasmidis recombinants pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine plasmidis en combinació amb la infecció del quist de G. duodenalis.Grup experimental: els ratolins van rebre 100 µg de pcDNA3.ADN plasmidi 1(+)-giardina (im), després 3 dies després, es van injectar 1,5 × 106 quists/ratolí mitjançant sonda.El pes corporal de cada ratolí es va controlar després de la introducció del quist de G. duodenalis a través del tub.Es va recollir duodè fresc per a mesures de càrrega parasitària i anàlisi de tinció d'HE.
Els canvis histopatològics es van analitzar segons un procediment publicat prèviament [30].El duodè fresc es va fixar amb un fixador de cèl·lules de teixit, es va incrustar en parafina, es va tallar en seccions de 4 μm, es va tacar amb H&E i es va analitzar amb un microscopi lleuger.Els canvis patològics representatius en set seccions de teixit de set ratolins independents van ser avaluats per un patòleg que no coneixia el tractament i es van capturar amb un augment de 200x.La longitud de les vellositats i la profunditat de les criptes es van mesurar d'acord amb els mètodes descrits anteriorment.
Els resultats in vitro i in vivo es van obtenir per triplicat.Els gràfics es van generar mitjançant GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA).Les diferències entre dos grups es van analitzar mitjançant la prova t, mentre que les diferències entre ≥3 grups es van analitzar mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) mitjançant el programari SPSS (versió 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, EUA).Les dades es van analitzar per a l'homogeneïtat de la variància mitjançant la prova de Levene seguida de la prova post hoc de Bonferroni (B).La significació s'expressa com P<0,05, P<0,01 i P<0,001 (no significatiu [ns]) (P>0,05).
La nostra anàlisi anterior de la proteòmica de GEV a l'Enciclopèdia de Gens i Genomes de Kyoto (KEGG) va demostrar que molts objectius poden estar implicats en l'activació de vies de senyalització inflamatòria [13].Hem seleccionat dues dianes prometedores, alfa-2 i alfa-7.3 giardines, amplifiquem aquestes molècules i les utilitzem per construir el vector d'expressió eucariota pcDNA3.1(+).Després de la seqüenciació, els plasmidis recombinants d'expressió pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardine es van transfectar en macròfags peritoneals primaris de ratolí i es va identificar la proteïna d'inflamació de la signatura caspasa-1 p20 (un fragment de caspasa-1 activada). com a dilucidar molècules clau que poden desencadenar la inflamació.Els resultats van mostrar que les giardines alfa-2 i alfa-7.3 poden induir una expressió p20 caspasa-1 similar a GEV.No es va trobar cap efecte sobre l'activació de la caspasa-1 al control negatiu no tractat (només PBS) i al control plasmidi pcDNA3.1 (+) (figura 1).
Mesura de l'activació de la p20 caspasa-1 per pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardines.Els plasmidis d'expressió eucariota recombinants pcDNA3.1(+)-alfa-2 i alfa-7.3 giardines (a sobre de cada carril) es van transfectar en macròfags peritoneals primaris de ratolí i es van recollir sobrenedants de cultiu 24 hores després.Es va utilitzar Western blotting per mesurar els nivells d'expressió de la proteïna inflamasoma p20 caspasa-1.El grup de tractament només amb PBS (carril C) i el grup de monoteràpia pcDNA3.1 (+) (carril pcDNA3.1) es van utilitzar com a control negatiu i el grup de tractament GEV es va utilitzar com a control positiu.L'expressió de la proteïna recombinant es va confirmar mitjançant la detecció d'una etiqueta d'histidina a cada proteïna, i les bandes de proteïnes esperades eren alfa-2 giardine (38,2 kDa) i alfa-7,3 giardine (37,2 kDa).GEV, vesícules extracel·lulars de Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), vector linealitzat EcoRV, SUP, sobrenedant
Per determinar si l'alfa-2 giardine i l'alfa-7.3 giardine indueixen l'expressió p20 caspasa-1 i juguen un paper en l'activació de la resposta inflamatòria de l'hoste NLRP3, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine i pcDNA3.1(+)-alfa -7,3 giardina es va transfectar a macròfags peritoneals primaris de ratolí amb ADN plasmidi recombinant i es van determinar els nivells d'expressió, localització i oligomerització de les proteïnes inflamatòries clau NLRP3.En aquest experiment, es va utilitzar GEV com a grup de control positiu i el grup sense tractament (només PBS) o el grup de tractament de transfecció pcDNA3.1(+) va ser el grup negatiu.Els resultats van mostrar que, com en el grup GEV, l'ADN plasmidi recombinant de giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 i giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 va donar lloc a la regulació de NLRP3, pro-IL-1β i activació de la procaspasa-1 i la caspasa-1 (Fig. 2a).A més, ambdues giardines van induir una secreció significativa d'IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alfa-7,3 giardina: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F (4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Figura 2b).La majoria de proteïnes ASC eren monomèriques en el grup sense tractament o en el grup de tractament transfectat amb el plasmidi pcDNA3.1(+), en contrast amb pcDNA3.1(+)-alfa-2 o pcDNA3.1(+)-alfa- 7.3 giardina.L'oligomerització ASC es va produir a l'ADN plasmidi recombinant del grup o grup control positiu GEV, mostrant una forma oligomèrica (figura 2c).Aquestes dades preliminars suggereixen que la giardina alfa-2 i la giardina alfa-7,3 poden induir l'activació de la inflamació de NLRP3.Estudis immunofluorescents posteriors de la localització d'ASC i NLRP3 van demostrar que en el grup de control negatiu, la proteïna ASC es va escampar per tot el citoplasma i va aparèixer com un senyal de punt després de l'estimulació de pcDNA3.1(+)-alfa-2 amb giardina o pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 grup giardina o grup control positiu GEV (figura 2d).En els grups pcDNA 3.1 de control negatiu i tractats amb plasmidi, no es va detectar el senyal de proteïna NLRP3, mentre que un punt de senyal fluorescent en resposta a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 es va detectar..Les giardines es troben al citoplasma o després de l'estimulació del VHE (Fig. 2e).Aquestes dades demostren a més que G. duodenalis giardin alfa-2 i giardin alfa-7.3 activen l'inflamsoma NLRP3 en macròfags peritoneals primaris del ratolí.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin i pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin activen l'inflamsoma NLRP3 als macròfags peritoneals del ratolí.Transfectar els plasmidis d'expressió eucariota recombinant pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin i pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin en macròfags i cèl·lules peritoneals primaris, o collir el sobrenedant en 24 h per a l'anàlisi de l'expressió, oligomerització , secreció.i localització de proteïnes inflamatòries clau.El grup PBS només (C) i el grup de tractament únic pcDNA3.1 (+) es van utilitzar com a control negatiu i el grup de tractament GEV es va utilitzar com a grup positiu.a Les proteïnes inflamatòries clau NLRP3, incloent NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 i p20 caspase-1, es van detectar mitjançant Western blotting.b Els nivells de secreció d'IL-1β en els sobrenedants es van determinar mitjançant un assaig immunosorbent lligat a enzims (ELISA).Les diferències entre els grups de control i experimentals es van analitzar mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) mitjançant el programari SPSS versió 22.0.Els asteriscs indiquen diferències significatives entre els grups **P<0,01 i ***P<0,001.c Els nivells d'oligomerització d'ASC en pellets es van determinar mitjançant l'anàlisi de reticulació DSS, mentre que els nivells d'ASC en lisats cel·lulars es van utilitzar com a control de càrrega.d Visualització de la localització d'ISC mitjançant immunofluorescència.La immunofluorescència es va utilitzar per visualitzar la localització de NLRP3.ASC, proteïna apoptòtica semblant a mota;IL, interleucina;NLRP3, receptor 3 semblant a l'oligomerització d'unió de nucleòtids;ns, no significatiu (P > 0,05)
Tant G. duodenalis com els GEV que secreta activen l'inflamsoma NLRP3 i regulen les respostes inflamatòries de l'hoste in vitro.Així, el paper de l'inflammasoma NLRP3 en la patogenicitat de G. duodenalis no està clar.Per investigar aquest problema, vam dissenyar un experiment entre ratolins infectats amb quist de G. duodenalis i ratolins infectats amb tractament amb quist de G. duodenalis + inhibidor de MCC950 i vam comparar l'expressió del inflamasoma NLRP3 quan es va infectar amb quist de G. duodenalis.A la figura 3a es mostra un esquema detallat de l'experiment.Els canvis en el pes corporal dels ratolins en diferents grups de tractament es van controlar durant 7 dies després de la infecció amb quists, i els resultats es mostren a la figura 3b.En comparació amb el grup tractat amb PBS pur, els resultats van mostrar que (i) el pes corporal dels ratolins infectats amb quist de G. duodenalis va disminuir del dia 3 al dia 7 després de la infecció;(ii) el tractament amb l'inhibidor MCC950 no va tenir cap efecte significatiu sobre el pes corporal dels ratolins..En comparació amb el grup d'infecció única, el BW del grup d'infecció duodenal tractat amb MCC950 va disminuir en diferents graus (Dia 1: ANOVA, F (3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Dia 2: ANOVA, F (3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001 Dia 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010, Dia 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052, F (3, 24)=0,6497, P=0,0645 Dia 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175, Dia 7: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202;Aquestes dades demostren que l'inflammasoma NLRP3 protegeix els ratolins de la pèrdua de pes important en les primeres etapes (2-4 dies) de la infecció duodenal.Aleshores vam tenir com a objectiu detectar trofozoïts de G. duodenalis al líquid de rentat duodenal i els resultats es mostren a la figura 3c.En comparació amb el grup d'infecció per quists de G. duodenalis, el nombre de trofozoïts al duodè va augmentar significativament després de bloquejar l'inflamsoma NLRP3 (t (12) = 2,902, P = 0,0133).Els teixits duodenals tacats amb HE van mostrar, en comparació amb el control negatiu tractat només amb PBS i MCC950: (i) La infecció per quists de G. duodenalis va provocar danys a les vellositats duodenals (ANOVA, F (3, 24) = 0,4903, P = 0,0488 ) i atròfia de la cripta (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodè de ratolins infectats amb quists de G. duodenalis i tractats amb inhibidors de MCC950.Les vellositats duodenals estaven danyades i mortes (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) amb atròfia i ramificació de la cripta (ANOVA, F (3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d-). f) .Aquests resultats suggereixen que l'inflammasoma NLRP3 juga un paper en la reducció de la patogenicitat de G. duodenalis.
Paper de l'inflamsoma NLRP3 en la infecció per Giardia duodenum.Els ratolins van ser sondats (iv) amb quists duodenocòccics i després tractats amb o sense MCC950 (ip).Es van utilitzar grups de tractament únic amb PBS o MCC950 com a controls.Grup experimental i règim de tractament.b El pes corporal dels ratolins en cadascun dels diferents grups de tractament es va controlar durant 7 dies.La diferència entre el grup d'infecció per G. duodenalis i el grup de tractament de la infecció per G. duodenalis + MCC950 es va analitzar mitjançant la prova t utilitzant el programari SPSS versió 22.0.Els asteriscs indiquen diferències significatives a *P<0,05, **P<0,01 o ***P<0,001.c Es va determinar la càrrega parasitària comptant el nombre de trofozoïts en el líquid de rentat duodenal.La diferència entre el grup d'infecció per G. duodenalis i el grup de tractament de la infecció per G. duodenalis + MCC950 es va analitzar mitjançant la prova t utilitzant el programari SPSS versió 22.0.Els asteriscs indiquen diferències significatives a * P < 0,05.d Resultats de la tinció d'hematoxilina i eosina (H&E) de la histopatologia duodenal.Les fletxes vermelles indiquen danys a les vellositats, les fletxes verdes indiquen danys a les criptes.Barra d'escala: 100 µm.e, f Anàlisi estadística de l'alçada de les vellositats duodenals i de l'alçada de la cripta del ratolí.Els asteriscs indiquen diferències significatives a *P<0,05 i **P<0,01.Els resultats són extrets de 7 experiments biològics independents.BW, pes corporal;ig, via de lliurament intragàstric;ip, via de lliurament intraperitoneal;ns, no significatiu (P > 0,05);PBS, solució salina tamponada amb fosfat;WT, tipus salvatge
La secreció d'IL-1β és un segell distintiu de l'activació de la inflamació.Per determinar si G. duodenalis alfa-2 giardine i alfa-7.3 giardine activen l'inflamsoma hoste NLRP3 in vivo, hem utilitzat ratolins WT no tractats (grup simulat) i ratolins bloquejats amb inflamasoma NLRP3 (grup de tractament inhibit MCC950).A la figura 4a es mostra un esquema detallat de l'experiment.Els grups experimentals estaven formats per ratolins tractats amb PBS, tractament de quists de G. duodenalis per sonda, injecció intramuscular de pcDNA3.1 i injecció intramuscular de pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine o pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.El 7è dia després de l'administració intramuscular del plasmidi recombinant, es va recollir sèrum i es va determinar el nivell d'IL-1β a cada grup.Com es mostra a la figura 4b, al grup MOCK: (i) en comparació amb el grup PBS, el tractament amb pcDNA3.1 no va tenir cap efecte significatiu sobre la secreció d'IL-1β (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), tanmateix, La secreció d'IL-β es va elevar significativament al grup de quists de G. duodenalis (ANOVA, F (4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine i pcDNA3.1- La injecció intramuscular d'alfa-7,3 giardina va augmentar significativament els nivells sèrics d'IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardine va induir alts nivells de secreció d'IL -1β al grup d'injecció intramuscular de pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F (4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .En comparació amb cada grup del grup de tractament MCC950 i el grup MOCK: (i) Els nivells de secreció d'IL-1β al grup control PBS i al grup control pcDNA3.1 van disminuir fins a cert punt després de bloquejar l'inhibidor MCC950, però la diferència no va ser significatiu (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) després de bloquejar MCC950., la secreció d'IL-1β es va reduir significativament en el grup infectat amb quists de G. duodenalis, el grup de giardines pcDNA3.1-alfa-2 i el grup de giardines pcDNA3.1-alfa-7.3 (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-alfa-2 giardina: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-alfa-7,3 giardina: ANOVA, F (9, 58). ) = 3,540, P = 0,0164).Aquests resultats suggereixen que la giardina alfa-2 i la giardina alfa-7.3 medien l'activació de l'inflamsoma NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardines activen l'inflamsoma hoste NLRP3 in vivo.Els ratolins es van immunitzar (IM) amb plasmidi d'expressió eucariota recombinant pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine i després es van tractar amb MCC950 (ip; grup MCC950) o no (grup fictici). ).El grup de tractament amb plasmidi PBS o pcDNA3.1(+) es va utilitzar com a control negatiu, el grup de tractament de quists de G. duodenalis es va utilitzar com a control positiu.Grup experimental i règim de tractament.b Els nivells sèrics d'IL-1β en ratolins es van mesurar el dia 7 mitjançant un assaig ELISA.Les diferències entre els grups del grup MOCK es van analitzar mitjançant ANOVA unidireccional i les diferències entre el grup MOCK i el grup MCC950 es van analitzar mitjançant la prova t del programari SPSS versió 22.0.Els asteriscs indiquen diferències significatives entre els grups de tractament del grup MOCK, *P<0,05 i ***P<0,001;Els signes de dòlar ($) indiquen diferències significatives entre cada grup del grup MOCK i el grup MCC950 a P<0,05.Resultats de set experiments biològics independents.i, injecció intramuscular, ns, no significatiu (P > 0,05)
Per investigar l'efecte de l'activació mediada per la giardina alfa-2 i alfa-7.3 de l'inflamsoma hoste NLRP3 sobre la infectivitat de G. duodenalis, vam utilitzar ratolins WT C57BL/6 i vam injectar alfa-2 giardina i alfa-7.3 giardine.el plasmidi es va injectar per via intramuscular, després de 3 dies a través del tub gàstric del quist de G. duodenalis, després del qual es van observar els ratolins durant 7 dies.A la figura 5a es mostra un esquema detallat de l'experiment.El pes corporal de cada ratolí es va mesurar cada dia, es van recollir mostres de teixit duodenal fresc el 7è dia després de l'administració a través d'un tub gàstric, es va mesurar el nombre de trofozoïts i es van observar canvis histopatològics.Com es mostra a la figura 5b, amb l'augment del temps d'alimentació, el BW dels ratolins de cada grup va augmentar gradualment.La MT dels ratolins va començar a disminuir el 3r dia després de l'administració intragàstrica de quists de G. duodenalis, i després va augmentar gradualment.L'activació de l'inflamsoma NLRP3 induïda per la injecció intramuscular d'alfa-2 giardine i alfa7.3 giardine va atenuar significativament la pèrdua de pes en ratolins (dia 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0,9754 Dia 1: giardina pcDNA3.1-alfa-7.3, ANOVA, F (4, 30) = 1,399, P = 0,9987 Dia 2: giardina pcDNA3.1-alfa-2, ANOVA, F ( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; Dia 2: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409: pcDNA3,1-alfa-2 giardine, ANOVA; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dia 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0,8222, P = 0,0083 Dia 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Dia 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P <0,0001, Dia 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P <0,0001 Dia 5: pcDNA3.1-alfa -7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P <0,0001 Dia 6: pcDNA3 ,1 - alfa-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Dia 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dia 7: giardina pcDNA3.1-alfa-2, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Dia 7: giardina pcDNA3.1-alfa-7,3, ANOVA, F (4, 30) = 0,5369, P <0,0001).La càrrega parasitària es va valorar al duodè (Fig. 5c).En comparació amb el control positiu no tractat i el grup injectat amb el vector pcDNA3.1 buit, el nombre de trofozoïts de G. duodenalis es va reduir significativament en els grups injectats amb α-2 giardina i α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha). -2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina: ANOVA, F (3, 24) = 1,209, P<0,0001).A més, la giardina alfa-7,3 va ser més protectora en els ratolins que la giardina alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Els resultats de la tinció amb HE es mostren a la fig.5d-f.Els ratolins injectats amb alfa-2 giardine i alfa-7.3 giardine tenien menys lesions del teixit duodenal, manifestades per danys a les vellositats, en comparació amb els ratolins injectats amb G. duodenalis i els ratolins injectats amb G. duodenalis en combinació amb un vector pcDNA3 buit .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardina: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 o P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina: ANOVA, F (3, 24) = 2,466, P = 0,0028 o P = 0,0055) i atròfia de la cripta reduïda (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.470, P = 0.0264 o P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 o P = 0,0191).Aquests resultats suggereixen que l'alfa-2 giardine i l'alfa-7,3 giardine redueixen la infectivitat de G. duodenalis activant l'inflamsoma NLRP3 in vivo.
Paper de pcDNA3.1(+)-giardines en la infecció per G. duodenalis.Els ratolins es van immunitzar (IM) amb plasmidis d'expressió eucariota recombinants pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine i després es van desafiar amb quists de G. duodenalis (ig).El grup PBS i el grup de tractament de quists duodenals pcDNA3.1(+) + es van utilitzar com a grups de control negatiu i el grup de tractament de quists duodenals es va utilitzar com a grup de control positiu.Grup experimental i règim de tractament.b La MT dels ratolins en cadascun dels diferents grups de tractament es va controlar durant 7 dies després del repte.Els asteriscs indiquen diferències significatives entre els grups del grup G. duodenalis i el grup pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine, *P <0,05, **P <0,01 i ***P <0,001;el signe del dòlar ($) indica una diferència significativa entre cada grup de G. duodenalis i el grup pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0,01 i $$$P<0,001.c La càrrega parasitària es va determinar comptant el nombre de trofozoïts en 1 ml de rentat duodenal del duodè (3 cm de llarg) i es va expressar com el nombre de paràsits per cm de duodè.Les diferències entre el grup d'infecció per G. duodenalis, el grup pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine i el grup pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine es van analitzar mitjançant ANOVA unidireccional mitjançant la versió 22.0 del programari SPSS.Els asteriscs indiquen diferències significatives a **P<0,01 i ***P<0,001.d Canvis histopatològics en el duodè.Les fletxes vermelles indiquen danys a les vellositats, les fletxes verdes indiquen danys a les criptes.Barra d'escala: 100 µm.e, f Anàlisi estadística de l'alçada de les vellositats duodenals del ratolí (e) i l'alçada de la cripta (f).Les diferències entre els grups de la figura 1d es van analitzar mitjançant ANOVA unidireccional mitjançant la versió 22.0 del programari SPSS.Els asteriscs indiquen diferències significatives a *P<0,05 i **P<0,01.Resultats de set experiments biològics independents.ns, no significatiu (P > 0,05)
Giardia duodenum és un paràsit intestinal conegut dels humans i altres mamífers que causa la giardiasi.El 2004, es va incloure a la Iniciativa de Malalties Desateses de l'OMS a causa de la seva alta prevalença durant 6 anys, especialment en comunitats de baix nivell socioeconòmic [32].El sistema immunitari innat té un paper crític en la resposta immune a la infecció per G. duodenalis.S'ha informat que els macròfags de ratolí engoleixen i maten G. duodenalis alliberant trampes extracel·lulars [33].Els nostres estudis anteriors han demostrat que G. duodenalis, un paràsit extracel·lular no invasiu, activa les vies de senyalització inflamatòria p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 i NLRP3 als macròfags del ratolí per regular les respostes inflamatòries de l'hoste, i el GEV alliberat pot millorar aquest procés.13], 24].Tanmateix, els PAMP exactes implicats en la inflamació regulada per l'inflamsoma NLRP3 en GEV i el paper de l'inflamsoma NLRP3 en la giardiasi encara no s'han dilucidat.Per aclarir aquestes dues preguntes, hem realitzat aquest estudi.
L'inflamsoma NLRP3 es troba al citoplasma de les cèl·lules immunitàries i pot ser activat per diverses partícules com ara cristalls d'àcid úric, toxines, bacteris, virus i paràsits.En estudis bacterians, les toxines s'han identificat com a PAMP clau que activen sensors inflamatoris, provocant inflamació i mort cel·lular [34].Algunes toxines estructuralment diverses, com l'hemolisina de Staphylococcus aureus [35] i Escherichia coli [36], l'hemolisina BL (HBL) de l'enterotoxina (NHE) [37], indueixen l'activació de la inflamació de NLRP3.Els estudis virals han demostrat que les proteïnes de virulència com la proteïna de l'embolcall (E) SARS-COV-2 [38] i la proteïna NS5 del virus Zika [39] són PAMP importants reconeguts pel receptor NLRP3.En estudis de paràsits, s'ha informat que molts paràsits estan associats amb l'activació de l'inflamsoma hoste, com ara Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] i Leishmania [42].Les proteïnes denses de grànuls GRA35, GRA42 i GRA43, associades a la virulència de Toxoplasma gondii, són necessàries per a la inducció de piroptosi en macròfags de rata Lewis [43].A més, alguns estudis de Leishmania s'han centrat en molècules individuals implicades en l'inflamsoma NLRP3, com el lipofosfoglicà de membrana del paràsit [44] o la metaloproteasa de zinc [45].Entre la família de gens alfa-giardin semblant a l'annexina, s'ha demostrat que l'alfa-1 giardin és un candidat potencial a la vacuna que proporciona protecció contra G. duodenalis en un model de ratolí [18].En el nostre estudi, vam seleccionar els factors de virulència de G. duodenalis alfa-2 i alfa-7,3 giardines, que són únics de giardia però relativament menys informats.Aquests dos gens objectiu es van clonar al vector del sistema d'expressió eucariota pcDNA3.1(+) per a l'anàlisi de l'activació de la inflamació.
En el nostre model de ratolí, els fragments de caspasa escindits serveixen com a marcadors d'activació inflamatòria.Després de l'estimulació, NLRP3 interacciona amb ASC, recluta procaspases i genera caspases actives que uneixen pro-IL-1β i pro-IL-18 en IL-1β i IL-18 madures, respectivament -18.Les caspases inflamatòries (caspases-1, -4, -5 i -11) són una família conservada de cisteïna proteases que són crítiques per a la defensa innata i estan implicades en la inflamació i la mort cel·lular programada [46].La caspasa-1 s'activa pels inflamasomes canònics [47], mentre que les caspases-4, -5 i -11 s'escindeixen durant la formació d'inflamsomes atípics [48].En aquest estudi, vam utilitzar macròfags peritoneals de ratolí com a model i vam investigar la caspasa-1 escindida per p20 caspase-1 com a marcador de l'activació de la inflamació de NLRP3 hoste en estudis d'infecció per G. duodenalis.Els resultats van mostrar que moltes alfa-giardines són responsables de l'activació típica de la inflamació, que és coherent amb el descobriment de molècules clau de virulència implicades en bacteris i virus.Tanmateix, el nostre estudi és només una pantalla preliminar i hi ha altres molècules que poden activar inflammasomes no clàssics, ja que el nostre estudi anterior va trobar inflammasomes clàssics i no clàssics en la infecció per G. duodenalis [13].Per determinar encara més si la p20 caspasa-1 generada s'associa amb l'inflamsoma NLRP3, vam transfectar alfa-2 i alfa-7.3 giardines en macròfags peritoneals de ratolí per determinar els nivells d'expressió de proteïnes de molècules clau i els nivells d'oligomerització ASC, confirmant que les dues α-giardines s'activen. inflamasoma NLRP3.Els nostres resultats són lleugerament diferents dels de Manko-Prykhoda et al., que van informar que l'estimulació de cèl·lules Caco-2 amb soques EPEC de G. muris o E. coli només pot augmentar la intensitat de fluorescència de NLRP3, ASC i caspasa-1, encara que no de manera significativa, mentre que la coestimulació de G. muris i E. coli va augmentar els nivells de tres proteïnes [49].Aquesta discrepància pot ser deguda a diferències en la selecció d'espècies de Giardia, línies cel·lulars i cèl·lules primàries.També vam realitzar assajos in vivo amb MCC950 en ratolins WT C57BL/6 femelles de 5 setmanes, que són més susceptibles a G. duodenalis.MCC950 és un inhibidor potent i selectiu de molècules petites de NLRP3 que bloqueja l'activació canònica i no canònica de NLRP3 a concentracions nanomolars.MCC950 inhibeix l'activació de NLRP3, però no afecta l'activació de les vies inflamatòries AIM2, NLRC4 i NLRP1 o les vies de senyalització TLR [27].MCC950 bloqueja l'activació de NLRP3 però no inhibeix la iniciació de NLRP3, l'eflux de K+, l'afluència de Ca2+ ni la interacció entre NLRP3 i ASC;en canvi, inhibeix l'activació de l'inflamsoma NLRP3 bloquejant l'oligomerització ASC [27].Per tant, vam utilitzar MCC950 en un estudi in vivo per determinar el paper de l'inflamsoma NLRP3 després de la injecció de giardina.La caspasa-1 p10 activada escinda les citocines proinflamatòries pro-IL-1β i pro-IL-18 en IL-1β i IL-18 madures [50].En aquest estudi, els nivells sèrics d'IL-1β en ratolins tractats amb giardina amb o sense MCC950 es van utilitzar com a indicador de si l'inflamsoma NLRP3 estava activat.Com era d'esperar, el tractament amb MCC950 va reduir significativament els nivells sèrics d'IL-1β.Aquestes dades demostren clarament que G. duodenalis giardin alfa-2 i giardin alfa-7.3 són capaços d'activar l'inflammasoma del ratolí NLRP3.
Les dades significatives acumulades durant l'última dècada han demostrat que IL-17A és el regulador mestre de la immunitat contra G. muris, induint la senyalització IL-17RA, produint pèptids antimicrobians i regulant l'activació del complement [51].Tanmateix, la infecció per Giardia es produeix amb més freqüència en adults joves, i s'ha informat que la infecció per Giardia en ratolins joves no activa la resposta IL-17A per exercir el seu efecte protector [52], cosa que va portar els investigadors a buscar altres Giardia immunomoduladora.mecanismes d'infecció per helmints.Els autors d'un estudi recent van informar que G. muris pot activar l'inflamsoma NLRP3 per E. coli EPEC, que promou la producció de pèptids antimicrobians i redueix la seva capacitat d'adhesió i el nombre de trofozoïts al tracte intestinal, reduint així la gravetat del còlon. malalties causades per bacils [49].L'inflamsoma NLRP3 està implicat en el desenvolupament de diverses malalties.Els estudis han demostrat que Pseudomonas aeruginosa desencadena l'autofàgia en els macròfags per evitar la mort cel·lular, i aquest procés depèn de l'activació de l'inflamsoma NLRP3 [53].Per a N. caninum, l'activació mediada per espècies reactives d'oxigen de l'inflamsoma NLRP3 limita la seva replicació a l'hoste, el que el converteix en un objectiu terapèutic potencial [9].S'ha trobat que Paracoccidioides brasiliensis indueix l'activació de l'inflamsoma NLRP3 a les cèl·lules dendrítiques derivades de la medul·la òssia del ratolí, donant lloc a l'alliberament de la citocina inflamatòria IL-1β, que té un paper crític en la defensa de l'hoste [10].Diverses espècies de Leishmania, incloses L. amazonensis, L. major, L. braziliensis i L. infantum chagasi, activen NLRP3 i la caspasa-1 dependent de l'ASC als macròfags, així com la infecció per Leishmania.La replicació del paràsit es millora en ratolins amb deficiència en el gen NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.S'ha informat que la infecció per Leishmania indueix l'activació de l'inflamsoma NLRP3 als macròfags, la qual cosa limita la replicació intracel·lular del paràsit.Així, la Leishmania pot inhibir l'activació de NLRP3 com a estratègia d'evitació.En estudis in vivo, l'inflamsoma NLRP3 va contribuir a l'eliminació de Leishmania, però no va afectar els teixits [54].Per contra, en estudis d'helmintiasi, l'activació de l'inflamsoma NLRP3 va suprimir la immunitat protectora de l'hoste contra l'helmintiasi gastrointestinal [12].Shigella és un dels principals bacteris causants de diarrea a tot el món.Aquests bacteris poden induir la producció d'IL-1β mitjançant l'eflux de K + mediat pel receptor P2X7, espècies reactives d'oxigen, acidificació lisosomal i dany mitocondrial.L'inflamsoma NLRP3 regula negativament la fagocitosi i l'activitat bactericida dels macròfags contra Shigella [55].Els estudis de Plasmodium han demostrat que els ratolins amb deficiència d'AIM2, NLRP3 o caspasa-1 infectats amb Plasmodium produeixen nivells elevats d'interferó tipus 1 i són més resistents a la infecció per Plasmodium [56].Tanmateix, el paper de l'alfa-2 giardine i l'alfa-7.3 giardine en la inducció de l'activació patògena de la inflamació de NLRP3 en ratolins no està clar.
En aquest estudi, la inhibició de l'inflamsoma NLRP3 per MCC950 va reduir el BW i va augmentar el nombre de trofozoïts en el líquid de rentat intestinal en ratolins, donant lloc a canvis patològics més greus en el teixit duodenal.La giardina alfa-2 i la giardina alfa-7.3 activen l'inflamsoma NLRP3 del ratolí hoste, augmenten el pes corporal del ratolí, redueixen el nombre de trofozoïts en el líquid de rentat intestinal i alleugen lesions duodenals patològiques.Aquests resultats suggereixen que G. duodenalis pot activar l'inflamsoma hoste NLRP3 mitjançant alfa-2 giardine i alfa-7,3 giardine, reduint la patogenicitat de G. duodenalis en ratolins.
Col·lectivament, els nostres resultats demostren que les giardines alfa-2 i alfa-7.3 indueixen l'activació de l'inflamsoma hoste NLRP3 i redueixen la infectivitat de G. duodenalis en ratolins.Per tant, aquestes molècules són objectius prometedors per a la prevenció de la giardiasi.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasi: una visió general.Recentment es va revelar que Pat Inflamm és al·lèrgic a les drogues.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasi: una revisió de la farmacoteràpia.Opinió experta d'un farmacèutic.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasi, resistència als medicaments i descobriment de noves dianes.Infecta les dianes de fàrmacs del trastorn.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, etc. NLRP3 inflamasoma i malalties inflamatòries.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. El paper de l'inflamsoma en la inflamació intestinal i el càncer.Gastroenterologia.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Activació canònica i atípica del inflamasoma NLRP3 a la cruïlla de la tolerància immune i la inflamació intestinal.preimmune.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.L'activació de l'inflamsoma NLRP3 mediada per ROS està implicada en resposta a la infecció per N. caninum.Vector paràsit.2020;13:449.