Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
Toxoplasma gondii és un paràsit protozou intracel·lular que modula el microambient de l'hoste infectat i se sap que està associat amb la incidència del creixement del tumor cerebral.En aquest estudi, es planteja la hipòtesi que el miRNA-21 exosomal de la infecció per Toxoplasma promou el creixement del tumor cerebral.Es van caracteritzar els exosomes de la microglia BV2 infectada amb Toxoplasma i es va confirmar la internalització de cèl·lules de glioma U87.Els perfils d'expressió de microRNA exosomals es van analitzar mitjançant matrius de microRNA i microRNA-21A-5p associats amb Toxoplasma gondii i classificació de tumors.També vam investigar els nivells d'ARNm dels gens associats al tumor a les cèl·lules de glioma U87 alterant els nivells de miR-21 als exosomes i l'efecte dels exosomes en la proliferació de cèl·lules de glioma U87 humà.En els exosomes de cèl·lules de glioma U87 infectades amb Toxoplasma gondii, augmenta l'expressió de microRNA-21 i es redueix l'activitat dels gens antitumorals (FoxO1, PTEN i PDCD4).Els exosomes derivats de BV2 infectats amb Toxoplasma indueixen la proliferació de cèl·lules de glioma U87.Els exosomes indueixen el creixement de cèl·lules U87 en un model de tumor de ratolí.Suggerim que l'augment de miR-21 exosomal a la microglia BV2 infectada amb Toxoplasma pot tenir un paper important com a promotor del creixement cel·lular a les cèl·lules del glioma U87 mitjançant la regulació a la baixa dels gens antitumorals.
S'estima que es van diagnosticar més de 18,1 milions de casos de càncer avançat a tot el món el 2018, amb uns 297.000 tumors del sistema nerviós central diagnosticats cada any (1,6% de tots els tumors)1.Investigacions anteriors han demostrat que els factors de risc per desenvolupar tumors cerebrals humans inclouen diversos productes químics, antecedents familiars i radiacions ionitzants procedents d'equips terapèutics i de diagnòstic del cap.No obstant això, es desconeix la causa exacta d'aquestes malalties.Aproximadament el 20% de tots els càncers a tot el món són causats per agents infecciosos, inclosos virus, bacteris i paràsits3,4.Els patògens infecciosos alteren els mecanismes genètics de la cèl·lula hoste, com ara la reparació de l'ADN i el cicle cel·lular, i poden provocar inflamació crònica i danys al sistema immunitari5.
Els agents infecciosos associats al càncer humà són els patògens virals més comuns, inclosos els virus del papil·loma humà i els virus de l'hepatitis B i C.Els paràsits també poden tenir un paper potencial en el desenvolupament del càncer humà.Diverses espècies de paràsits, com Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis i Hymenolepis nana, han estat implicades en diversos tipus de càncer humà 6,7,8.
Toxoplasma gondii és un protozou intracel·lular que regula el microambient de les cèl·lules hoste infectades.Es calcula que aquest paràsit infecta aproximadament el 30% de la població mundial, posant en risc tota la població9,10.Toxoplasma gondii pot infectar òrgans vitals, inclòs el sistema nerviós central (SNC), i causar malalties greus com la meningitis i l'encefalitis mortals, especialment en pacients immunodeprimits9.Tanmateix, Toxoplasma gondii també pot alterar l'entorn de l'hoste infectat modulant el creixement cel·lular i les respostes immunitàries en individus immunocompetents, donant lloc al manteniment d'una infecció crònica asimptomàtica9,11.Curiosament, donada la correlació entre la prevalença de T. gondii i la incidència del tumor cerebral, alguns informes suggereixen que els canvis ambientals de l'hoste in vivo a causa de la infecció crònica per T. gondii s'assemblen al microambient del tumor.
Els exosomes es coneixen com a comunicadors intercel·lulars que proporcionen contingut biològic, incloses proteïnes i àcids nucleics, de cèl·lules veïnes16,17.Els exosomes poden influir en processos biològics relacionats amb el tumor, com ara l'anti-apoptosi, l'angiogènesi i la metàstasi en el microambient del tumor.En particular, els miRNAs (miRNAs), petits ARN no codificants d'uns 22 nucleòtids de longitud, són importants reguladors de gens post-transcripcionals que controlen més del 30% de l'ARNm humà mitjançant el complex de silenciament induït per miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii pot interrompre els processos biològics controlant l'expressió de miRNA en hostes infectats.Els miRNA de l'hoste contenen senyals importants per regular els processos biològics de l'hoste per aconseguir l'estratègia de supervivència del paràsit.Així, estudiar els canvis en el perfil de miRNA hoste després de la infecció per T. gondii ens pot ajudar a entendre més clarament la interacció entre l'hoste i T. gondii.De fet, Thirugnanam et al.15 va suggerir que T. gondii promou la carcinogènesi cerebral alterant la seva expressió en miRNA hoste específics associats amb el creixement del tumor i va trobar que T. gondii pot causar gliomes en animals d'experimentació.
Aquest estudi se centra en l'alteració del miR-21 exosomal a la microglia hoste infectada amb Toxoplasma BV2.Vam observar un possible paper del miR-21 exosomal alterat en el creixement de cèl·lules de glioma U87 a causa de la retenció al nucli de FoxO1/p27, que és l'objectiu del miR-21 sobreexpressat.
Els exosomes derivats de BV2 es van obtenir mitjançant centrifugació diferencial i es van validar per diversos mètodes per evitar la contaminació amb components cel·lulars o altres vesícules.L'electroforesi en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) va mostrar patrons diferents entre proteïnes extretes de cèl·lules BV2 i exosomes (figura 1A), i es van avaluar mostres per determinar la presència d'Alix, que es va analitzar mitjançant Western blotting de marcadors de proteïnes exosomals a .L'etiquetatge d'Alix es va trobar a les proteïnes exosomes, però no a les proteïnes de lisat de cèl·lules BV2 (Fig. 1B).A més, es va analitzar l'ARN purificat d'exosomes derivats de BV2 mitjançant un bioanalitzador.Les subunitats ribosòmiques 18S i 28S rarament es van observar en el patró de migració de l'ARN exosomal, cosa que indica una puresa fiable (figura 1C).Finalment, la microscòpia electrònica de transmissió va demostrar que els exosomes observats tenien una mida d'uns 60-150 nm i tenien una estructura semblant a una copa típica de la morfologia dels exosomes (Fig. 1D).
Caracterització d'exosomes derivats de cèl·lules BV2.(A) Pàgina de la fitxa de dades de seguretat.Les proteïnes es van aïllar de cèl·lules BV2 o exosomes derivats de BV2.Els patrons proteics difereixen entre cèl·lules i exosomes.(B) Anàlisi Western blot d'un marcador exosomal (Alix).(C) Avaluació de l'ARN purificat de cèl·lules BV2 i exosomes derivats de BV2 mitjançant un bioanalitzador.Així, les subunitats ribosòmiques 18S i 28S a les cèl·lules BV2 es van trobar poques vegades a l'ARN exosomal.(D) La microscòpia electrònica de transmissió va mostrar que els exosomes aïllats de les cèl·lules BV2 es van tacar negativament amb un 2% d'acetat d'uranil.Els exosomes tenen una mida aproximadament de 60-150 nm i tenen forma de copa (Song i Jung, dades no publicades).
Es va observar la internalització cel·lular d'exosomes derivats de BV2 en cèl·lules de glioma humà U87 mitjançant microscòpia confocal.Els exosomes marcats amb PKH26 es localitzen al citoplasma de les cèl·lules U87.Els nuclis es van tacar amb DAPI (Fig. 2A), cosa que indica que els exosomes derivats de BV2 poden ser interioritzats per cèl·lules hostes i influir en l'entorn de les cèl·lules receptores.
La internalització d'exosomes derivats de BV2 en cèl·lules de glioma U87 i exosomes derivats de BV2 infectats amb Toxoplasma RH va induir la proliferació de cèl·lules de glioma U87.(A) Exosomes absorbits per cèl·lules U87 mesurades per microscòpia confocal.Les cèl·lules de glioma U87 es van incubar amb exosomes marcats amb PKH26 (vermell) o sense control durant 24 hores.Els nuclis es van tacar amb DAPI (blau) i després es van observar sota un microscopi confocal (barra d'escala: 10 μm, x 3000).(B) La proliferació de cèl·lules de glioma U87 es va determinar mitjançant un assaig de proliferació cel·lular.Les cèl·lules de glioma U87 es van tractar amb exosomes durant el temps indicat. * P < 0,05 es va obtenir mitjançant la prova t de Student. * P < 0,05 es va obtenir mitjançant la prova t de Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0,05 per la prova t de Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtingut mitjançant la prova t de Student.
Després de confirmar la internalització d'exosomes derivats de BV2 en cèl·lules de glioma U87, vam realitzar assajos de proliferació cel·lular per investigar el paper dels exosomes derivats de Toxoplasma derivats de BV2 en el desenvolupament de cèl·lules de glioma humà.El tractament de cèl·lules U87 amb exosomes de cèl·lules BV2 infectades per T. gondii va mostrar que els exosomes derivats de BV2 infectats per T. gondii van provocar una proliferació significativament més gran de cèl·lules U87 en comparació amb el control (Fig. 2B).
A més, el creixement de cèl·lules U118 va tenir els mateixos resultats que U87, ja que els exosomes estimulats per Toxoplasma van provocar els nivells més alts de proliferació (dades no mostrades).A partir d'aquestes dades, podem indicar que els exosomes infectats amb Toxoplasma derivats de BV2 tenen un paper important en la proliferació de cèl·lules del glioma.
Per investigar l'efecte dels exosomes derivats de BV2 infectats amb Toxoplasma en el desenvolupament del tumor, vam injectar cèl·lules de glioma U87 en ratolins nus per a un model de xenograft i vam injectar exosomes derivats de BV2 o exosomes derivats de BV2 infectats amb RH.Després que els tumors es fessin evidents després d'una setmana, cada grup experimental de 5 ratolins es va dividir segons la mida del tumor per determinar el mateix punt de partida i es va mesurar la mida del tumor durant 22 dies.
En els ratolins amb el model de xenograft U87, es va observar una mida i pes del tumor significativament més grans en el grup d'exosomes infectats amb RH derivat de BV2 el dia 22 (Fig. 3A, B).D'altra banda, no hi va haver cap diferència significativa en la mida del tumor entre el grup d'exosomes derivats de BV2 i el grup control després del tractament amb exosomes.A més, els ratolins injectats amb cèl·lules de glioma i exosomes mostraven visualment el volum tumoral més gran del grup d'exosomes derivats de BV2 infectats amb RH (Fig. 3C).Aquests resultats demostren que els exosomes infectats amb Toxoplasma derivats de BV2 indueixen el creixement del glioma en un model de tumor de ratolí.
Oncogènesi (AC) d'exosomes derivats de BV2 en un model de ratolí xenograft U87.La mida del tumor (A) i el pes (B) van augmentar significativament en ratolins nus BALB/c tractats amb exosomes infectats amb RH derivats de BV2.Els ratolins nus BALB/c (C) es van injectar per via subcutània amb 1 x 107 cèl·lules U87 suspeses a la barreja de Matrigel.Sis dies després de la injecció, es van tractar 100 μg d'exosomes derivats de BV2 en ratolins.La mida i el pes del tumor es van mesurar els dies indicats i després del sacrifici, respectivament. *P <0,05. *P <0,05. * Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. * Р < 0,05. *P <0,05.
Les dades van mostrar que 37 miRNAs (16 sobreexpressats i 21 baixexpressats) associats amb la immunitat o el desenvolupament del tumor es van alterar significativament a la microglia després de la infecció amb la soca Toxoplasma RH (Fig. 4A).Els nivells d'expressió relativa de miR-21 entre els miRNA alterats es van confirmar mitjançant RT-PCR en temps real en exosomes derivats de BV2, exosomes tractats amb cèl·lules BV2 i U87.L'expressió de miR-21 va mostrar un augment significatiu dels exosomes de les cèl·lules BV2 infectades amb Toxoplasma gondii (soca RH) (Fig. 4B).Els nivells d'expressió relativa de miR-21 a les cèl·lules BV2 i U87 van augmentar després de la captació d'exosomes alterats (Fig. 4B).Els nivells relatius d'expressió de miR-21 en els teixits cerebrals dels pacients amb tumor i els ratolins infectats amb Toxoplasma gondii (soca ME49) eren més alts que en els controls, respectivament (Fig. 4C).Aquests resultats es correlacionen amb diferències entre els nivells d'expressió dels microARN predits i confirmats in vitro i in vivo.
Canvis en l'expressió de miP-21a-5p exosomal a la microglia infectada amb Toxoplasma gondii (RH).(A) Demostra canvis significatius en el siRNA associats amb la immunitat o el desenvolupament del tumor després de la infecció per T. gondii RH.(B) Els nivells d'expressió relatius de miR-21 es van detectar mitjançant RT-PCR en temps real en exosomes derivats de BV2, exosomes tractats amb BV2 i cèl·lules U87.(C) Es van trobar nivells d'expressió de miR-21 relatius als teixits cerebrals de pacients amb tumor (N = 3) i ratolins infectats amb Toxoplasma gondii (soca ME49) (N = 3). * P < 0,05 es va obtenir mitjançant la prova t de Student. * P < 0,05 es va obtenir mitjançant la prova t de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0, 05 es va obtenir mitjançant la prova t de Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtingut mitjançant la prova t de Student.
Els exosomes de cèl·lules BV2 infectades amb RH van provocar el creixement de gliomes in vivo i in vitro (Fig. 2, 3).Per detectar ARNm rellevants, es van examinar els nivells d'ARNm de gens diana antitumorals, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN i mort cel·lular programada 4 (PDCD4) en cèl·lules U87 infectades amb exosomes derivats de BV2 o RH BV2.L'anàlisi bioinformàtica ha demostrat que diversos gens associats al tumor, inclosos els gens FoxO1, PTEN i PDCD4, tenen llocs d'unió miR-2121,22.Els nivells d'ARNm dels gens diana antitumorals es van reduir en els exosomes derivats de BV2 infectats amb RH en comparació amb els exosomes derivats de BV2 (Fig. 5A).FoxO1 va mostrar nivells de proteïnes reduïts en exosomes derivats de BV2 infectats amb RH en comparació amb exosomes derivats de BV2 (figura 5B).A partir d'aquests resultats, podríem confirmar que els exosomes derivats de BV2 infectat per RH regulen a la baixa els gens anti-oncogènics, mantenint el seu paper en el creixement del tumor.
Els exosomes derivats de BV2 infectats amb Toxoplasma RH indueixen la supressió dels gens antitumorals a les cèl·lules del glioma U87 per exosomes derivats de BV2 infectats amb Toxoplasma RH.(A) PCR en temps real de l'expressió FoxO1, PTEN i PDCD4 en exosomes derivats de BV2 infectat amb RH de T. gondii en comparació amb exosomes PBS.Es va utilitzar l'ARNm de β-actina com a control.(B) L'expressió de FoxO1 es va determinar mitjançant Western blotting i les dades de densitometria es van avaluar estadísticament mitjançant el programa ImageJ. * P < 0,05 es va obtenir mitjançant la prova t de Student. * P < 0,05 es va obtenir mitjançant la prova t de Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * P <0, 05 es va obtenir mitjançant la prova t de Student. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 obtingut mitjançant la prova t de Student.
Per entendre l'efecte de miP-21 en exosomes en la regulació gènica associada al tumor, les cèl·lules U87 es van transfectar amb un inhibidor de miP-21 mitjançant Lipofectamine 2000 i les cèl·lules es van collir 24 hores després de la transfecció.Els nivells d'expressió de FoxO1 i p27 en cèl·lules transfectades amb inhibidors de miR-21 es van comparar amb cèl·lules tractades amb exosomes derivats de BV2 mitjançant qRT-PCR (Fig. 6A, B).La transfecció de l'inhibidor de miR-21 a cèl·lules U87 va reduir significativament l'expressió FoxO1 i p27 (FIG. 6).
El miP-21 derivat de BV2 exosomal infectat amb RH va alterar l'expressió FoxO1/p27 a les cèl·lules de glioma U87.Les cèl·lules U87 es van transfectar amb inhibidor de miP-21 mitjançant Lipofectamine 2000 i les cèl·lules es van collir 24 hores després de la transfecció.Els nivells d'expressió de FoxO1 i p27 a les cèl·lules transfectades amb inhibidors de miR-21 es van comparar amb els nivells de cèl·lules tractades amb exosomes derivats de BV2 mitjançant qRT-PCR (A, B).
Per escapar de la resposta immune de l'hoste, el paràsit Toxoplasma es transforma en un quist de teixit.Parasiten diversos teixits, inclosos el cervell, el cor i el múscul esquelètic, durant tota la vida de l'hoste i modulen la resposta immune de l'hoste.A més, poden regular el cicle cel·lular i l'apoptosi de les cèl·lules hoste, afavorint la seva proliferació14,24.Toxoplasma gondii infecta predominantment les cèl·lules dendrítiques hoste, els neutròfils i el llinatge de monòcits/macròfags, inclosa la microglia cerebral.Toxoplasma gondii indueix la diferenciació de macròfags del fenotip M2, afecta la cicatrització de ferides després de la infecció per patògens i també s'associa amb hipervascularització i fibrosi granulomatosa.Aquesta patogènesi conductual de la infecció per Toxoplasma pot estar relacionada amb marcadors associats al desenvolupament del tumor.L'entorn hostil regulat per Toxoplasma pot assemblar-se al precàncer corresponent.Per tant, es pot suposar que la infecció per Toxoplasma hauria de contribuir al desenvolupament de tumors cerebrals.De fet, s'han informat taxes elevades d'infecció per Toxoplasma en el sèrum de pacients amb diversos tumors cerebrals.A més, Toxoplasma gondii pot ser un altre efector cancerígen i actuar de manera sinèrgica per ajudar altres carcinògens infecciosos a desenvolupar tumors cerebrals.En aquest sentit, val la pena assenyalar que P. falciparum i el virus d'Epstein-Barr contribueixen de manera sinèrgica a la formació del limfoma de Burkitt.
S'ha investigat àmpliament el paper dels exosomes com a reguladors en el camp de la investigació del càncer.Tanmateix, el paper dels exosomes entre els paràsits i els hostes infectats segueix sent poc conegut.Fins ara, diversos reguladors, incloses les proteïnes secretades, han explicat els processos biològics pels quals els paràsits protozous resisteixen l'atac de l'hoste i perpetuen la infecció.Recentment, hi ha hagut un concepte creixent que les microvesícules associades a protozous i els seus microARN interactuen amb les cèl·lules hoste per crear un entorn favorable per a la seva supervivència.Per tant, es necessiten més estudis per descobrir la relació entre els miRNA exosomals alterats i la proliferació de cèl·lules de glioma.L'alteració del microARN (gens de clúster miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 i miR-17-92) s'uneix al promotor STAT3 en macròfags humans infectats amb toxoplasma, està regulada i indueix anti -apoptosi en resposta a la infecció per Toxoplasma gondii 29 .La infecció per toxoplasma augmenta l'expressió de miR-17-5p i miR-106b-5p, que s'associen a diverses malalties hiperproliferatives 30 .Aquestes dades suggereixen que els miRNA de l'hoste regulats per la infecció per Toxoplasma són molècules importants per a la supervivència dels paràsits i la patogènesi en el comportament biològic de l'hoste.
Els miRNA alterats poden influir en diversos tipus de comportament durant l'inici i la progressió de cèl·lules malignes, inclosos els gliomes: autosuficiència dels senyals de creixement, insensibilitat als senyals inhibidors del creixement, evasió de l'apoptosi, potencial replicatiu il·limitat, angiogènesi, invasió i metàstasi i inflamació.Al glioma, s'han identificat miRNA alterats en diversos estudis de perfil d'expressió.
En el present estudi, vam confirmar nivells elevats d'expressió de miRNA-21 en cèl·lules hoste infectades amb toxoplasma.El miR-21 s'ha identificat com un dels microARN sobreexpressats amb més freqüència en tumors sòlids, inclosos els gliomes, 33 i la seva expressió es correlaciona amb el grau de glioma.L'evidència acumulada suggereix que miR-21 és un nou oncogen que actua com a factor anti-apoptòtic en el creixement del glioma i està altament sobreexpressat en teixits i plasma de tumors malignes del cervell humà.Curiosament, la inactivació de miR-21 a les cèl·lules i teixits del glioma desencadena la inhibició de la proliferació cel·lular a causa de l'apoptosi dependent de la caspasa.L'anàlisi bioinformàtica dels objectius predits de miR-21 va revelar múltiples gens supressors de tumors associats a vies d'apoptosi, incloent la mort cel·lular programada 4 (PDCD4), tropomiosina (TPM1), PTEN i forkhead box O1 (FoxO1), amb el lloc d'unió de miR-2121..22.38.
FoxO1, com un dels factors de transcripció (FoxO), està implicat en el desenvolupament de diversos tipus de càncer humà i pot regular l'expressió de gens supressors de tumors com p21, p27, Bim i FasL40.FoxO1 pot unir i activar inhibidors del cicle cel·lular com p27 per suprimir el creixement cel·lular.A més, FoxO1 és un efector clau de la senyalització PI3K/Akt i regula molts processos biològics com la progressió del cicle cel·lular i la diferenciació cel·lular mitjançant l'activació de la transcripció de p2742.
En conclusió, creiem que el miR-21 exosomal derivat de la microglia infectada amb Toxoplasma pot tenir un paper important com a regulador del creixement de les cèl·lules del glioma (Fig. 7).Tanmateix, es necessiten més estudis per trobar un enllaç directe entre el miR-21 exosomal, la infecció alterada per Toxoplasma i el creixement del glioma.S'espera que aquests resultats proporcionin un punt de partida per estudiar la relació entre la infecció per Toxoplasma i la incidència del glioma.
En aquest estudi es proposa un diagrama esquemàtic del mecanisme de la carcinogènesi del glioma (cervell).L'autor dibuixa a PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Tots els protocols experimentals d'aquest estudi, inclòs l'ús d'animals, estaven d'acord amb les directrius ètiques estàndard del Comitè d'usuaris i cura dels animals de la Universitat Nacional de Seül i van ser aprovats pel Comitè de Revisió Institucional de l'Escola de Medicina de la Universitat Nacional de Seül (número IRB SNU- 150715).-2).Tots els procediments experimentals es van dur a terme d'acord amb les recomanacions d'ARRIVE.
La microglia de ratolí BV2 i les cèl·lules de glioma humà U87 es van cultivar al medi d'àguila modificat de Dulbecco (DMEM; Welgene, Seül, Corea) i al medi del Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), respectivament, cadascuna conté un 10% de sèrum fetal boví, 4 mM l- glutamina, penicil·lina 0,2 mM i estreptomicina 0,05 mM.Les cèl·lules es van cultivar en una incubadora amb un 5% de CO2 a 37 °C.Es va utilitzar una altra línia cel·lular de glioma, U118, per a la comparació amb les cèl·lules U87.
Per aïllar exosomes de soques RH i ME49 infectades per T. gondii, es van recollir taquizoïts de T. gondii (soca RH) de la cavitat abdominal de ratolins BALB/c de 6 setmanes injectats 3-4 dies abans.Els taquizoïts es van rentar tres vegades amb PBS i es van purificar per centrifugació en Percoll al 40% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA)43.Per obtenir taquizoïts de la soca ME49, es van injectar intraperitonealment ratolins BALB/c amb 20 quists de teixit i es va recollir la transformació de taquizoïts en quists rentant la cavitat abdominal el 6-8è dia després de la infecció (PI).Ratolins infectats amb PBS.Els taquizoïts ME49 es van cultivar en cèl·lules complementades amb 100 μg/ml de penicil·lina (Gibco/BRL, Grand Island, NY, EUA), 100 μg/ml d'estreptomicina (Gibco/BRL) i sèrum boví fetal al 5% (Lonza, Walkersville, MD) .., EUA) a 37 °C i un 5% de diòxid de carboni.Després del cultiu a les cèl·lules Vero, els taquizoïts ME49 es van passar dues vegades a través d'una agulla de calibre 25 i després a través d'un filtre de 5 µm per eliminar les restes i les cèl·lules.Després del rentat, els taquizoïts es van tornar a suspendre en PBS44.Els quists de teixit de la soca ME49 de Toxoplasma gondii es van mantenir mitjançant injecció intraperitoneal de quists aïllats del cervell de ratolins C57BL/6 infectats (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Corea).Els cervells dels ratolins infectats amb ME49 es van collir després de 3 mesos de PI i es van picar sota un microscopi per aïllar els quists.Els ratolins infectats es van mantenir en condicions especials lliures de patògens (SPF) a l'Escola de Medicina de la Universitat Nacional de Seül.
L'ARN total es va extreure d'exosomes, cèl·lules i teixits BV2 derivats de BV2 mitjançant el kit miRNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemanya) segons les instruccions del fabricant, inclòs el temps d'incubació per al pas d'elució.La concentració d'ARN es va determinar amb un espectrofotòmetre NanoDrop 2000.La qualitat dels microarrays d'ARN es va avaluar mitjançant un bioanalitzador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Països Baixos).
Es va preparar DMEM amb un 10% de FBS pobre en exosomes mitjançant ultracentrifugació a 100.000 g durant 16 hores a 4 ° C i es va filtrar a través d'un filtre de 0, 22 µm (Nalgene, Rochester, NY, EUA).Les cèl·lules BV2, 5 × 105, es van cultivar en DMEM que contenia un 10% de FBS esgotat d'exosomes i un 1% d'antibiòtics a 37 ° C i un 5% de CO2.Després de 24 hores d'incubació, es van afegir taquizoïts de la soca RH o ME49 (MOI = 10) a les cèl·lules i es van eliminar els paràsits no invasors en una hora i es van tornar a omplir amb DMEM.Els exosomes de les cèl·lules BV2 es van aïllar mitjançant centrifugació diferencial modificada, el mètode més utilitzat.Resuspendre el sediment d'exosoma en 300 µl de PBS per a l'anàlisi d'ARN o proteïnes.La concentració d'exosomes aïllats es va determinar mitjançant un kit d'assaig de proteïnes BCA (Pierce, Rockford, IL, EUA) i un espectrofotòmetre NanoDrop 2000.
Els precipitats de cèl·lules BV2 o exosomes derivats de BV2 es van lisar en una solució d'extracció de proteïnes PRO-PREP ™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Corea) i les proteïnes es van carregar a gels de poliacrilamida SDS al 10% amb color blau brillant de Coomassie.A més, les proteïnes es van transferir a membranes de PVDF durant 2 hores.Els Western blots es van validar mitjançant l'anticòs Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA) com a marcador exosomal.Es van utilitzar com a anticossos secundaris IgG anti-ratolí de cabra conjugada amb HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, EUA) i un analitzador d'imatges luminescents LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tòquio, Japó)..Es va realitzar una microscòpia electrònica de transmissió per estudiar la mida i la morfologia dels exosomes.Es van preparar exosomes aïllats de cèl·lules BV2 (6, 40 µg/µl) sobre malles recobertes de carboni i es van tacar negativament amb acetat d'uranil al 2% durant 1 min.Les mostres preparades es van observar a una tensió acceleradora de 80 kV mitjançant un JEOL 1200-EX II (Tòquio, Japó) equipat amb una càmera CCD Erlangshen ES1000W (Gatan, Pleasanton, CA, EUA).
Els exosomes derivats de BV2 es van tacar mitjançant el kit d'enllaç fluorescent vermell PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) durant 15 minuts a temperatura ambient.Les cèl·lules U87, 2 × 105, amb exosomes marcats amb PKH26 (vermell) o sense exosomes com a control negatiu, es van incubar a 37 ° C durant 24 hores en una incubadora al 5% de CO2.Els nuclis de cèl·lules U87 es van tacar amb DAPI (blau), les cèl·lules U87 es van fixar en paraformaldehid al 4% durant 15 min a 4 ° C i després es van analitzar en un sistema de microscopi confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Alemanya).observable.
L'ADNc es va sintetitzar a partir de siRNA mitjançant la síntesi de la primera cadena de siRNA Mir-X i el kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japó).La PCR quantitativa en temps real es va realitzar mitjançant el sistema de detecció de PCR en temps real iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) utilitzant primers i plantilles barrejades amb SYBR Premix.L'ADN es va amplificar durant 40 cicles de desnaturalització a 95 °C durant 15 s i recuit a 60 °C durant 60 s.Les dades de cada reacció de PCR es van analitzar mitjançant el mòdul d'anàlisi de dades del programari del sistema òptic iQ™5 (Bio-Rad).Els canvis relatius en l'expressió gènica entre els gens diana seleccionats i la β-actina/siRNA (i U6) es van calcular mitjançant el mètode de corba estàndard.Les seqüències d'imprimació utilitzades es mostren a la taula 1.
Es van sembrar 3 x 104 cèl·lules de glioma U87 en plaques de 96 pous i es van barrejar amb exosomes infectats amb Toxoplasma derivats de BV2 (50 μg/mL) o exosomes sense pols derivats de BV2 (50 μg/mL) com a controls a les 12, 18 i 36 hores. .La taxa de proliferació cel·lular es va determinar mitjançant el Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japó) (Figures suplementàries S1-S3) 46 .
Es van comprar ratolins nus BALB/c femelles de 5 setmanes a Orient Bio (Seongnam-si, Corea del Sud) i es van mantenir individualment en gàbies estèrils a temperatura ambient (22 ± 2 ° C) i humitat (45 ± 15 ° C).%) a temperatura ambient (22±2°C) i humitat (45±15%).Es va realitzar un cicle de llum de 12 hores i un cicle fosc de 12 hores sota SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Els ratolins es van dividir aleatòriament en tres grups de 5 ratolins cadascun i es van injectar tots els grups per via subcutània amb 400 ml de PBS que contenien 1 x 107 cèl·lules de glioma U87 i BD Matrigel™ amb factor de creixement reduït (BD Science, Miami, FL, EUA).Sis dies després de la injecció del tumor, es van injectar 200 mg d'exosomes derivats de cèl·lules BV2 (amb/sense infecció per Toxoplasma) al lloc del tumor.Vint-i-dos dies després de la infecció del tumor, la mida del tumor dels ratolins de cada grup es va mesurar amb un calibre tres vegades per setmana i el volum del tumor es va calcular mitjançant la fórmula: 0,5 × (amplada) × 2 × llarg.
Anàlisi de l'expressió de microRNA mitjançant la matriu de miRNA miRCURYTM LNA, 7a generació té, matrius mmu i rno (EXIQON, Vedbaek, Dinamarca) que cobreixen 1119 ratolins ben caracteritzats entre 3100 sondes de captura de miRNA humans, de ratolí i de rata.Durant aquest procediment, es van eliminar de 250 a 1000 ng d'ARN total del 5'-fosfat mitjançant un tractament amb fosfatasa alcalina intestinal de vedella seguit d'un etiquetatge amb colorant fluorescent verd Hy3.Les mostres etiquetades es van hibridar després carregant diapositives de microarrays mitjançant un kit de cambra d'hibridació (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) i un kit de diapositives d'hibridació (Agilent Technologies).La hibridació es va dur a terme durant 16 hores a 56 ° C, després es van rentar els microarrays d'acord amb les recomanacions del fabricant.A continuació, es van escanejar les diapositives de microarrays processades mitjançant un sistema d'escàner de microarrays Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Les imatges escanejades es van importar mitjançant la versió 10.7.3.1 del programari Agilent Feature Extraction (Agilent Technologies) i la intensitat de fluorescència de cada imatge es va quantificar mitjançant el fitxer GAL corresponent del protocol Exiqon modificat.Les dades de microarrays per a l'estudi actual es dipositen a la base de dades GEO amb el número d'accés GPL32397.
Es van analitzar els perfils d'expressió de miRNA exosomal madur a la microglia de soques RH o ME49 infectades amb Toxoplasma mitjançant diverses eines de xarxa.Els miRNAs associats al desenvolupament del tumor es van identificar mitjançant miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) i es van filtrar amb una intensitat de senyal normalitzada (log2) superior a 8,0.Entre els miRNAs, es va trobar que els miRNAs expressats de manera diferent estaven alterats més d'1,5 vegades mitjançant l'anàlisi de filtres de miRNAs alterats per soques RH o ME49 infectades amb T. gondii.
Les cèl·lules es van sembrar en plaques de sis pous (3 x 105 cèl·lules/pou) a opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) mitjançant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).Les cèl·lules transfectades es van cultivar durant 6 hores i després es va canviar el medi a un medi complet fresc.Les cèl·lules es van recollir 24 hores després de la transfecció.
L'anàlisi estadística es va realitzar principalment mitjançant la prova t de Student amb programari Excel (Microsoft, Washington, DC, EUA).Per a l'anàlisi experimental d'animals, es va realitzar un ANOVA bidireccional mitjançant el programari Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Els valors P <0, 05 es van considerar estadísticament significatius. Els valors p < 0,05 es van considerar estadísticament significatius. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Els valors de p <0,05 es van considerar estadísticament significatius. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Els valors de p <0,05 es van considerar estadísticament significatius.
Tots els protocols experimentals utilitzats en aquest estudi van ser aprovats per la Junta de Revisió Institucional de la Facultat de Medicina de la Universitat Nacional de Seül (número IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Incidència i mortalitat mundials per càncer estimades el 2018: fonts i mètodes de GLOBOCAN.Interpretació.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS Una visió dels factors de risc dels tumors cerebrals i les seves intervencions terapèutiques. Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS Una visió dels factors de risc dels tumors cerebrals i les seves intervencions terapèutiques.Rashid, S., Rehman, K. i Akash, MS Una revisió dels factors de risc per als tumors cerebrals i les principals intervencions terapèutiques. Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. i Akash, MS Comprensió profunda dels factors de risc del tumor cerebral i les intervencions terapèutiques.Rashid, S., Rehman, K. i Akash, MS Una revisió dels factors de risc per als tumors cerebrals i les principals intervencions terapèutiques.Ciència biomèdica.Farmacèutic.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. i Sun, J. Interaccions bacteriovíriques en càncers bucodigestius humans i del tracte genital femení: un resum de l'evidència epidemiològica i de laboratori. Kato, I., Zhang, J. i Sun, J. Interaccions bacteriovíriques en càncers bucodigestius humans i del tracte genital femení: un resum de l'evidència epidemiològica i de laboratori.Kato I., Zhang J. i Sun J. Interaccions bacteriovíriques en càncer del tracte gastrointestinal humà i del tracte genital femení: un resum de dades epidemiològiques i de laboratori. Kato, I., Zhang, J. i Sun, J. Kato, I., Zhang, J. i Sun, J. Interacció bacteri-viral en la digestió de la cavitat oral humana i el tracte reproductiu femení: resum de la ciència de malalties populars i evidència de laboratori.Kato I., Zhang J. i Sun J. Interaccions bacteriovíriques en càncer gastrointestinal humà i càncer genital femení: un resum de dades epidemiològiques i de laboratori.Càncer 14, 425 (2022).
Magon, KL i Parish, JL De la infecció al càncer: com els virus del tumor d'ADN alteren el metabolisme central del carboni i dels lípids de la cèl·lula hoste. Magon, KL i Parish, JL De la infecció al càncer: com els virus del tumor d'ADN alteren el metabolisme central del carboni i dels lípids de la cèl·lula hoste.Mahon, KL i Parish, JL Infecció del foc al càncer: com els virus tumorals basats en l'ADN alteren el metabolisme central del carboni i dels lípids de la cèl·lula hoste. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质䣂谢 Magon, KL & Parish, JL De la infecció al càncer: com els virus del tumor d'ADN alteren el metabolisme central del carboni i dels lípids de la cèl·lula hoste.Mahon, KL i Parish, JL Incendis infecció al càncer: com els virus del tumor d'ADN alteren el metabolisme central del carboni i dels lípids a les cèl·lules hostes.Biologia oberta.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Catecols d'estrògens d'esquistosomes i trematodes hepàtiques i càncer associat a helmints.davant.calor per dins.5, 444 (2014).