Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
Els vectors genètics per al tractament de la fibrosi quística pulmonar s'han d'orientar a les vies respiratòries conductores, ja que la transducció pulmonar perifèrica no té cap efecte terapèutic.L'eficiència de la transducció viral està directament relacionada amb el temps de residència del portador.Tanmateix, els fluids de lliurament com els portadors de gens es difonen de manera natural als alvèols durant la inhalació i les partícules terapèutiques de qualsevol forma s'eliminen ràpidament mitjançant el transport mucociliar.Ampliar el temps de residència dels portadors de gens a les vies respiratòries és important però difícil d'aconseguir.Les partícules magnètiques conjugades amb portadors que es poden dirigir a la superfície de les vies respiratòries poden millorar l'orientació regional.A causa de problemes amb la imatge in vivo, el comportament d'aquestes petites partícules magnètiques a la superfície de les vies respiratòries en presència d'un camp magnètic aplicat és poc conegut.L'objectiu d'aquest estudi va ser utilitzar imatges de sincrotró per visualitzar in vivo el moviment d'una sèrie de partícules magnètiques a la tràquea de rates anestesiades per tal d'estudiar la dinàmica i els patrons de comportament de partícules individuals i a granel in vivo.A continuació, també vam avaluar si el lliurament de partícules magnètiques lentivirals en presència d'un camp magnètic augmentaria l'eficiència de la transducció a la tràquea de rata.Les imatges de raigs X de sincrotró mostren el comportament de les partícules magnètiques en camps magnètics estacionaris i en moviment in vitro i in vivo.Les partícules no es poden arrossegar fàcilment per la superfície de les vies respiratòries vives mitjançant imants, però durant el transport, els dipòsits es concentren al camp de visió, on el camp magnètic és més fort.L'eficiència de la transducció també es va multiplicar per sis quan es van lliurar partícules magnètiques lentivirals en presència d'un camp magnètic.En conjunt, aquests resultats suggereixen que les partícules magnètiques lentivirals i els camps magnètics poden ser enfocaments valuosos per millorar l'orientació i els nivells de transducció de vectors gènics a les vies respiratòries conductores in vivo.
La fibrosi quística (FC) és causada per variacions en un sol gen anomenat regulador de conductància transmembrana de la CF (CFTR).La proteïna CFTR és un canal iònic que està present en moltes cèl·lules epitelials de tot el cos, incloses les vies respiratòries, un lloc important en la patogènesi de la fibrosi quística.Els defectes en CFTR condueixen a un transport d'aigua anormal, deshidratació de la superfície de la via aèria i una disminució de la profunditat de la capa de fluid de la superfície de la via aèria (ASL).També perjudica la capacitat del sistema de transport mucociliar (MCT) per netejar les vies respiratòries de partícules i patògens inhalats.El nostre objectiu és desenvolupar una teràpia gènica lentiviral (LV) per lliurar la còpia correcta del gen CFTR i millorar la salut pulmonar, ASL i MCT, i continuar desenvolupant noves tecnologies que puguin mesurar aquests paràmetres in vivo1.
Els vectors LV són un dels principals candidats a la teràpia gènica de la fibrosi quística, principalment perquè poden integrar permanentment el gen terapèutic a les cèl·lules basals de les vies respiratòries (cèl·lules mare de les vies respiratòries).Això és important perquè poden restaurar la hidratació normal i l'eliminació de la mucositat mitjançant la diferenciació en cèl·lules de la superfície de les vies respiratòries corregudes per gens funcionals associades a la fibrosi quística, donant lloc a beneficis per a tota la vida.Els vectors del VI s'han de dirigir contra les vies aèries conductores, ja que aquí és on comença la afectació pulmonar en la FQ.El lliurament del vector més profundament al pulmó pot donar lloc a una transducció alveolar, però això no té cap efecte terapèutic en la fibrosi quística.No obstant això, els fluids com els portadors de gens migren de manera natural als alvèols quan s'inhalen després del part3,4 i les partícules terapèutiques són expulsades ràpidament a la cavitat oral pels MCT.L'eficiència de la transducció de LV està directament relacionada amb el temps que el vector roman a prop de les cèl·lules diana per permetre l'absorció cel·lular: "temps de residència" 5 que es pot escurçar fàcilment pel flux d'aire regional típic, així com amb la captació coordinada de moc i partícules MCT.Per a la fibrosi quística, la capacitat d'allargar el temps de residència del LV a les vies respiratòries és important per aconseguir alts nivells de transducció en aquesta àrea, però fins ara ha estat un repte.
Per superar aquest obstacle, proposem que les partícules magnètiques LV (MP) poden ajudar de dues maneres complementàries.En primer lloc, poden ser guiats per un imant a la superfície de les vies respiratòries per millorar l'orientació i ajudar les partícules portadores de gens a estar a la zona correcta de les vies respiratòries;i ASL) es mouen a la capa cel·lular 6. Els MP s'utilitzen àmpliament com a vehicles d'admissió de fàrmacs dirigits quan s'uneixen a anticossos, fàrmacs de quimioteràpia o altres molècules petites que s'uneixen a les membranes cel·lulars o s'uneixen als seus respectius receptors de la superfície cel·lular i s'acumulen als llocs del tumor. presència d'electricitat estàtica.Camps magnètics per a la teràpia del càncer 7. Altres mètodes "hipertèrmics" tenen com a objectiu matar cèl·lules tumorals escalfant MP quan s'exposen a camps magnètics oscil·lants.El principi de transfecció magnètica, en què s'utilitza un camp magnètic com a agent de transfecció per millorar la transferència d'ADN a les cèl·lules, s'utilitza habitualment in vitro mitjançant una sèrie de vectors de gens no vírics i virals per a línies cel·lulars difícils de transduir. ..Es va establir l'eficiència de la magnetotransfecció LV amb el lliurament de LV MP in vitro a una línia cel·lular d'epiteli bronquial humà en presència d'un camp magnètic estàtic, augmentant l'eficiència de la transducció en 186 vegades en comparació amb el vector LV sol.LV MT també s'ha aplicat a un model in vitro de fibrosi quística, on la transfecció magnètica va augmentar la transducció de LV en cultius d'interfície aire-líquid per un factor de 20 en presència d'esput de fibrosi quística10.Tanmateix, la magnetotransfecció d'òrgans in vivo ha rebut relativament poca atenció i només s'ha avaluat en alguns estudis amb animals11,12,13,14,15, especialment als pulmons16,17.Tanmateix, les possibilitats de transfecció magnètica en la teràpia pulmonar en la fibrosi quística són clares.Tan et al.(2020) va afirmar que "un estudi de validació sobre el lliurament pulmonar efectiu de nanopartícules magnètiques obrirà el camí per a futures estratègies d'inhalació de CFTR per millorar els resultats clínics en pacients amb fibrosi quística"6.
El comportament de petites partícules magnètiques a la superfície de les vies respiratòries en presència d'un camp magnètic aplicat és difícil de visualitzar i estudiar i, per tant, s'entén poc.En altres estudis, hem desenvolupat un mètode d'imatge de raigs X de contrast de fase basat en la propagació de sincrotró (PB-PCXI) per a imatges no invasives i quantificació de canvis minúsculs in vivo en la profunditat d'ASL18 i el comportament de MCT19,20 per mesurar directament la hidratació de la superfície del canal de gas. i s'utilitza com a indicador primerenc de l'eficàcia del tractament.A més, el nostre mètode de puntuació MCT utilitza partícules de 10-35 µm de diàmetre compostes d'alúmina o vidre d'índex de refracció elevat com a marcadors MCT visibles amb PB-PCXI21.Tots dos mètodes són adequats per a la imatge de diversos tipus de partícules, inclosos els MP.
A causa de l'alta resolució espacial i temporal, els nostres assajos ASL i MCT basats en PB-PCXI són molt adequats per estudiar la dinàmica i els patrons de comportament de partícules individuals i a granel in vivo per ajudar-nos a entendre i optimitzar els mètodes d'entrega de gens MP.L'enfocament que fem servir aquí es basa en els nostres estudis amb la línia de llum SPring-8 BL20B2, en què vam visualitzar el moviment del fluid després del lliurament d'una dosi d'un vector simulat a les vies respiratòries nasals i pulmonars dels ratolins per ajudar a explicar els nostres patrons d'expressió gènica heterogenis observats. en el nostre gen.estudis en animals amb una dosi portadora de 3,4.
L'objectiu d'aquest estudi era utilitzar el sincrotró PB-PCXI per visualitzar els moviments in vivo d'una sèrie de MP a la tràquea de rates vives.Aquests estudis d'imatge PB-PCXI es van dissenyar per provar la sèrie MP, la força del camp magnètic i la ubicació per determinar el seu efecte sobre el moviment MP.Vam suposar que un camp magnètic extern ajudaria a la MF lliurada a romandre o a moure's a la zona objectiu.Aquests estudis també ens van permetre determinar configuracions d'imants que maximitzen la quantitat de partícules que queden a la tràquea després de la deposició.En una segona sèrie d'estudis, vam voler utilitzar aquesta configuració òptima per demostrar el patró de transducció resultant del lliurament in vivo de LV-MP a les vies respiratòries de la rata, en el supòsit que el lliurament de LV-MP en el context de l'orientació de les vies respiratòries resultaria. en l'augment de l'eficiència de transducció del LV..
Tots els estudis en animals es van realitzar d'acord amb els protocols aprovats per la Universitat d'Adelaida (M-2019-060 i M-2020-022) i el Comitè d'Ètica Animal del Sincrotró SPring-8.Els experiments es van dur a terme d'acord amb les recomanacions d'ARRIVE.
Totes les imatges de raigs X es van prendre a la línia de llum BL20XU al sincrotró SPring-8 al Japó mitjançant una configuració similar a la descrita anteriorment21,22.Breument, la caixa experimental es trobava a 245 m de l'anell d'emmagatzematge de sincrotró.S'utilitza una distància mostra-detector de 0,6 m per a estudis d'imatge de partícules i 0,3 m per a estudis d'imatge in vivo per crear efectes de contrast de fase.Es va utilitzar un feix monocromàtic amb una energia de 25 keV.Les imatges es van adquirir mitjançant un transductor de raigs X d'alta resolució (SPring-8 BM3) acoblat a un detector sCMOS.El transductor converteix els raigs X en llum visible mitjançant un centelleador de 10 µm de gruix (Gd3Al2Ga3O12), que després es dirigeix ​​al sensor sCMOS mitjançant un objectiu de microscopi ×10 (NA 0,3).El detector sCMOS era un Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japó) amb una mida de matriu de 2048 × 2048 píxels i una mida de píxels en brut de 6,5 × 6,5 µm.Aquesta configuració proporciona una mida de píxel isòtropa efectiva de 0,51 µm i un camp de visió d'aproximadament 1,1 mm × 1,1 mm.La durada de l'exposició de 100 ms es va escollir per maximitzar la relació senyal-soroll de les partícules magnètiques dins i fora de les vies respiratòries alhora que es minimitzen els artefactes de moviment causats per la respiració.Per als estudis in vivo, es va col·locar un obturador de raigs X ràpid a la ruta de raigs X per limitar la dosi de radiació bloquejant el feix de raigs X entre exposicions.
Els mitjans LV no es van utilitzar en cap estudi d'imatge SPring-8 PB-PCXI perquè la cambra d'imatge BL20XU no té la certificació de nivell 2 de bioseguretat.En lloc d'això, vam seleccionar una sèrie de MP ben caracteritzats de dos venedors comercials que cobreixen una varietat de mides, materials, concentracions de ferro i aplicacions, primer per entendre com els camps magnètics afecten el moviment dels MP en capil·lars de vidre, i després en vies respiratòries vives.superfície.La mida del MP varia de 0,25 a 18 µm i està feta de diversos materials (vegeu la taula 1), però es desconeix la composició de cada mostra, inclosa la mida de les partícules magnètiques del MP.A partir dels nostres estudis extensos de MCT 19, 20, 21, 23, 24, esperem que es puguin veure MP de fins a 5 µm a la superfície de la via aèria traqueal, per exemple, restant fotogrames consecutius per veure una millor visibilitat del moviment MP.Un únic MP de 0,25 µm és més petit que la resolució del dispositiu d'imatge, però s'espera que PB-PCXI detecti el seu contrast volumètric i el moviment del líquid superficial sobre el qual es dipositen després de ser dipositats.
Mostres per a cada MP de la taula.1 es va preparar en capil·lars de vidre de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, EUA) amb un diàmetre intern de 0, 63 mm.Les partícules corpusculars estan disponibles a l'aigua, mentre que les partícules CombiMag estan disponibles en el líquid patentat del fabricant.Cada tub s'omple a la meitat amb líquid (aproximadament 11 µl) i es col·loca al suport de la mostra (vegeu la figura 1).Els capil·lars de vidre es van col·locar horitzontalment a l'escenari a la cambra d'imatge, respectivament, i es van col·locar a les vores del líquid.Es va connectar un imant de carcassa de níquel de 19 mm de diàmetre (28 mm de llarg) fet de terres rares, neodimi, ferro i bor (NdFeB) (N35, núm. cat. LM1652, Jaycar Electronics, Austràlia) amb una remanència d'1,17 T. taula de transferència separada per aconseguir Canvieu la vostra posició de forma remota durant la representació.La imatge de raigs X comença quan l'imant es col·loca aproximadament 30 mm per sobre de la mostra i les imatges s'adquireixen a 4 fotogrames per segon.Durant la imatge, l'imant es va acostar al tub capil·lar de vidre (a una distància d'aproximadament 1 mm) i després es va moure al llarg del tub per avaluar l'efecte de la força i la posició del camp.
Una configuració d'imatge in vitro que conté mostres de MP en capil·lars de vidre en l'etapa de traducció de la mostra xy.El recorregut del feix de raigs X està marcat amb una línia de punts vermella.
Un cop establerta la visibilitat in vitro dels MP, es va provar un subconjunt d'ells in vivo en rates albines Wistar femelles de tipus salvatge (~ 12 setmanes, ~ 200 g).Medetomidina 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japó), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japó) i butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Les rates van ser anestesiades amb una barreja de Pharma (Japó) per injecció intraperitoneal.Després de l'anestèsia, es van preparar per a la imatge eliminant la pell al voltant de la tràquea, inserint un tub endotraqueal (ET; cànula intravenosa de 16 Ga, Terumo BCT) i immobilitzant-los en posició supina sobre una placa d'imatge feta a mida que conté una bossa tèrmica. per mantenir la temperatura corporal.22. A continuació, es va connectar la placa d'imatge a l'etapa de mostra a la caixa d'imatge amb un angle lleuger per alinear la tràquea horitzontalment a la imatge de raigs X, tal com es mostra a la figura 2a.
( a ) Configuració d'imatge in vivo a la unitat d'imatge SPring-8, camí del feix de raigs X marcat amb una línia de punts vermella.( b, c ) La localització de l'imant traqueal es va realitzar de forma remota mitjançant dues càmeres IP muntades ortogonalment.A la part esquerra de la imatge de la pantalla, podeu veure el bucle de filferro que subjecta el cap i la cànula de lliurament instal·lada dins del tub ET.
Es va connectar un sistema de bomba de xeringa controlada a distància (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) amb una xeringa de vidre de 100 µl a un tub PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) mitjançant una agulla de 30 Ga.Marqueu el tub per assegurar-vos que la punta estigui en la posició correcta a la tràquea quan introduïu el tub endotraqueal.Mitjançant una microbomba, es va treure l'èmbol de la xeringa i es va submergir la punta del tub a la mostra MP que es va lliurar.El tub de lliurament carregat es va inserir al tub endotraqueal, col·locant la punta a la part més forta del nostre camp magnètic aplicat esperat.L'adquisició d'imatges es va controlar mitjançant un detector d'alè connectat a la nostra caixa de cronometratge basada en Arduino, i tots els senyals (per exemple, temperatura, respiració, obertura/tancament de l'obturador i adquisició d'imatges) es van registrar mitjançant Powerlab i LabChart (AD Instruments, Sydney, Austràlia) Quan la carcassa no estava disponible, es van col·locar dues càmeres IP (Panasonic BB-SC382) a uns 90 ° l'una de l'altra i es van utilitzar per controlar la posició de l'imant respecte a la tràquea durant la imatge (figura 2b, c).Per minimitzar els artefactes de moviment, es va adquirir una imatge per respiració durant l'altiplà del flux respiratori terminal.
L'imant està connectat a la segona etapa, que es pot localitzar de forma remota a l'exterior del cos de la imatge.Es van provar diverses posicions i configuracions de l'imant, incloent: col·locat en un angle d'aproximadament 30 ° per sobre de la tràquea (les configuracions es mostren a les figures 2a i 3a);un imant per sobre de l'animal i l'altre per sota, amb els pols posats per a l'atracció (figura 3b)., un imant per sobre de l'animal i un per sota, amb els pols establerts per a la repulsió (figura 3c) i un imant per sobre i perpendicular a la tràquea (figura 3d).Després de configurar l'animal i l'imant i carregar el MP a prova a la bomba de xeringa, lliurar una dosi de 50 µl a una velocitat de 4 µl/s després de l'adquisició d'imatges.A continuació, l'imant es mou cap endavant i cap enrere al llarg o a través de la tràquea mentre es continua adquirint imatges.
Configuració d'imants per a imatges in vivo (a) un imant per sobre de la tràquea amb un angle d'aproximadament 30 °, (b) dos imants configurats per a l'atracció, (c) dos imants configurats per a la repulsió, (d) un imant per sobre i perpendicular a la tràquea.L'observador va mirar cap avall des de la boca fins als pulmons a través de la tràquea i el feix de raigs X va passar pel costat esquerre de la rata i va sortir pel costat dret.L'imant es mou al llarg de la via aèria o a l'esquerra i dreta per sobre de la tràquea en la direcció del feix de raigs X.
També es va intentar determinar la visibilitat i el comportament de les partícules a les vies respiratòries en absència de barreja de respiració i freqüència cardíaca.Per tant, al final del període d'imatge, els animals van ser sacrificats humanament a causa d'una sobredosi de pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, EUA; ~ 65 mg/kg ip).Alguns animals es van deixar a la plataforma d'imatge i, després del cessament de la respiració i els batecs del cor, el procés d'imatge es va repetir, afegint una dosi addicional de MP si no hi havia MP visible a la superfície de les vies respiratòries.
Les imatges resultants es van corregir pel camp pla i fosc i després es van reunir en una pel·lícula (20 fotogrames per segon; 15–25 × velocitat normal segons la freqüència de respiració) mitjançant un script personalitzat escrit a MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tots els estudis sobre el lliurament de vectors de gens LV es van realitzar al Centre de Recerca d'Animals de Laboratori de la Universitat d'Adelaida i tenien com a objectiu utilitzar els resultats de l'experiment SPring-8 per avaluar si el lliurament de LV-MP en presència d'un camp magnètic podria millorar la transferència de gens in vivo. .Per avaluar els efectes de la MF i el camp magnètic, es van tractar dos grups d'animals: un grup es va injectar amb LV MF amb col·locació d'imants i a l'altre grup se li va injectar un grup control amb LV MF sense imant.
Els vectors del gen LV s'han generat mitjançant mètodes descrits anteriorment 25, 26 .El vector LacZ expressa un gen de beta-galactosidasa localitzat nuclear impulsat pel promotor constitutiu MPSV (LV-LacZ), que produeix un producte de reacció blau a les cèl·lules transduïdes, visible en fronts i seccions del teixit pulmonar.La valoració es va realitzar en cultius cel·lulars comptant manualment el nombre de cèl·lules positives per a LacZ mitjançant un hemocitòmetre per calcular el títol en TU/ml.Els portadors es criopreserven a -80 °C, es descongelen abans del seu ús i s'uneixen a CombiMag barrejant 1:1 i incubant en gel durant almenys 30 minuts abans del lliurament.
Rates Sprague Dawley normals (n = 3/grup, ~ 2-3 ip anestesiades amb una barreja de 0,4 mg/kg de medetomidina (Domitor, Ilium, Austràlia) i 60 mg/kg de ketamina (Ilium, Austràlia) a 1 mes d'edat) ip ) injecció i canulació oral no quirúrgica amb una cànula intravenosa de 16 Ga.Per assegurar-se que el teixit de la via aèria traqueal rebi transducció de ventri ventricular, es va condicionar mitjançant el nostre protocol de pertorbació mecànica descrit anteriorment en què la superfície de la via aèria traqueal es fregava axialment amb una cistella de filferro (N-Circle, extractor de pedra de nitinol sense punta NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, EUA) 30 p28.Aleshores, uns 10 minuts després de la pertorbació al gabinet de bioseguretat, es va realitzar l'administració traqueal de LV-MP.
El camp magnètic utilitzat en aquest experiment es va configurar de manera similar a un estudi de raigs X in vivo, amb els mateixos imants subjectats sobre la tràquea amb pinces de stent de destil·lació (figura 4).Es va lliurar un volum de 50 µl (2 x 25 µl alíquotes) de LV-MP a la tràquea (n = 3 animals) mitjançant una pipeta amb punta de gel tal com es va descriure anteriorment.El grup control (n = 3 animals) va rebre el mateix LV-MP sense l'ús d'un imant.Un cop finalitzada la infusió, la cànula s'elimina del tub endotraqueal i s'extuba l'animal.L'imant roman al seu lloc durant 10 minuts abans de ser retirat.Les rates es van dosificar per via subcutània amb meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Austràlia) seguida de la retirada de l'anestèsia mitjançant la injecció intraperitoneal d'1 mg/kg de clorhidrat d'atipamazol (Antisedan, Zoetis, Austràlia).Les rates es van mantenir calentes i es van observar fins a la recuperació completa de l'anestèsia.
Dispositiu de lliurament LV-MP en un armari de seguretat biològica.Podeu veure que la màniga Luer-lock gris clar del tub ET sobresurt de la boca i la punta de la pipeta de gel que es mostra a la figura s'insereix a través del tub ET fins a la profunditat desitjada a la tràquea.
Una setmana després del procediment d'administració de LV-MP, els animals van ser sacrificats humanament mitjançant la inhalació de CO2 al 100% i es va avaluar l'expressió de LacZ mitjançant el nostre tractament estàndard X-gal.Es van eliminar els tres anells de cartílag més caudals per garantir que qualsevol dany mecànic o retenció de líquids a causa de la col·locació del tub endotraqueal no s'inclogués a l'anàlisi.Cada tràquea es va tallar longitudinalment per obtenir dues meitats per a l'anàlisi i es va col·locar en una tassa que contenia cautxú de silicona (Sylgard, Dow Inc) amb una agulla Minutien (Fine Science Tools) per visualitzar la superfície luminal.La distribució i el caràcter de les cèl·lules transduïdes es van confirmar mitjançant fotografia frontal mitjançant un microscopi Nikon (SMZ1500) amb una càmera DigiLite i programari TCapture (Tucsen Photonics, Xina).Les imatges es van adquirir amb un augment de 20x (incloent la configuració màxima per a tota l'amplada de la tràquea), amb tota la longitud de la tràquea mostrada pas a pas, proporcionant una superposició suficient entre cada imatge per permetre que les imatges es "cosin".Les imatges de cada tràquea es van combinar en una única imatge composta mitjançant l'editor d'imatges compostes versió 2.0.3 (Microsoft Research) mitjançant l'algoritme de moviment pla. L'àrea d'expressió LacZ dins de les imatges compostes traqueals de cada animal es va quantificar mitjançant un script MATLAB automatitzat (R2020a, MathWorks) tal com es va descriure anteriorment28, utilitzant paràmetres de 0,35 <Tonalitat <0,58, Saturació> 0,15 i Valor <0,7. L'àrea d'expressió LacZ dins de les imatges compostes traqueals de cada animal es va quantificar mitjançant un script MATLAB automatitzat (R2020a, MathWorks) tal com es va descriure anteriorment28, utilitzant paràmetres de 0,35 <Tonalitat <0,58, Saturació> 0,15 i Valor <0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. L'àrea d'expressió de LacZ en imatges traqueals compostes de cada animal es va quantificar mitjançant un script MATLAB automatitzat (R2020a, MathWorks) tal com s'ha descrit anteriorment28 mitjançant una configuració de 0,35.0,15 i valor <0,7.如 前所 述 ， 使用 自动 MATLAB 脚本 （R2020A ， Mathworks） 对 来自 只 动物 的 的 气管 复合 图像 中 的 Lacz 表达 区域 进行 ， ， 使用 0,35 <色调 <0,58 、 饱和度> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。。。。。。。。。。。。如 前所 述 ， 自动 自动 MATLAB 脚本 （（R2020A ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的 。。。。。 。。。。。 .................... MALUC Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Les àrees d'expressió de LacZ en imatges compostes de la tràquea de cada animal es van quantificar mitjançant un script MATLAB automatitzat (R2020a, MathWorks) tal com es va descriure anteriorment utilitzant paràmetres de 0, 35 < tonalitat < 0, 58, saturació > 0, 15 i valor < 0, 7.Mitjançant el seguiment dels contorns del teixit a GIMP v2.10.24, es va crear manualment una màscara per a cada imatge composta per identificar l'àrea del teixit i evitar deteccions falses fora del teixit traqueal.Les àrees tacades de totes les imatges compostes de cada animal es van sumar per donar l'àrea tacada total d'aquest animal.L'àrea pintada es va dividir després per l'àrea total de la màscara per obtenir una àrea normalitzada.
Cada tràquea es va incrustar en parafina i es va seccionar amb un gruix de 5 µm.Les seccions es van tacar amb vermell neutre ràpid durant 5 minuts i es van adquirir imatges mitjançant un microscopi Nikon Eclipse E400, una càmera DS-Fi3 i un programari de captura d'elements NIS (versió 5.20.00).
Totes les anàlisis estadístiques es van realitzar a GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).La significació estadística es va establir en p ≤ 0,05.La normalitat es va provar mitjançant la prova Shapiro-Wilk i es van avaluar les diferències en la tinció de LacZ mitjançant una prova t no aparellada.
Els sis MP descrits a la taula 1 van ser examinats per PCXI, i la visibilitat es descriu a la taula 2. Dos MP de poliestirè (MP1 i MP2; 18 µm i 0,25 µm, respectivament) no eren visibles per PCXI, però es van poder identificar les mostres restants. (A la figura 5 es mostren exemples).MP3 i MP4 són feblement visibles (10-15% Fe3O4; 0,25 µm i 0,9 µm, respectivament).Tot i que MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) contenia algunes de les partícules més petites provades, va ser la més pronunciada.El producte CombiMag MP6 és difícil de distingir.En tots els casos, la nostra capacitat per detectar MF es va millorar molt movent l'imant cap endavant i cap enrere paral·lel al capil·lar.A mesura que els imants s'allunyaven del capil·lar, les partícules es van extreure en cadenes llargues, però a mesura que els imants s'acostaven i la intensitat del camp magnètic augmentava, les cadenes de partícules es van escurçar a mesura que les partícules migraven cap a la superfície superior del capil·lar (vegeu el vídeo suplementari S1). : MP4), augmentant la densitat de partícules a la superfície.Per contra, quan s'elimina l'imant del capil·lar, la força del camp disminueix i els MP es reorganitzen en llargues cadenes que s'estenen des de la superfície superior del capil·lar (vegeu el vídeo suplementari S2: MP4).Després que l'imant deixi de moure's, les partícules continuen movent-se durant un temps després d'arribar a la posició d'equilibri.A mesura que el MP es mou cap a i allunyar-se de la superfície superior del capil·lar, les partícules magnètiques tendeixen a treure residus a través del líquid.
La visibilitat de MP sota PCXI varia considerablement entre mostres.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6.Totes les imatges que es mostren aquí es van prendre amb un imant situat aproximadament 10 mm directament per sobre del capil·lar.Els grans cercles aparents són bombolles d'aire atrapades als capil·lars, que mostren clarament les característiques de la vora en blanc i negre de la imatge de contrast de fase.El quadre vermell indica l'ampliació que millora el contrast.Tingueu en compte que els diàmetres dels circuits magnètics en totes les figures no són a escala i són aproximadament 100 vegades més grans del que es mostra.
A mesura que l'imant es mou a l'esquerra i a la dreta al llarg de la part superior del capil·lar, l'angle de la corda MP canvia per alinear-se amb l'imant (vegeu la figura 6), delimitant així les línies del camp magnètic.Per a MP3-5, després que la corda assoleixi l'angle llindar, les partícules arrosseguen la superfície superior del capil·lar.Això sovint fa que els MP s'agrupin en grups més grans prop d'on el camp magnètic és més fort (vegeu el vídeo suplementari S3: MP5).Això també és especialment evident quan s'obtenen imatges a prop de l'extrem del capil·lar, cosa que fa que el MP s'agregui i es concentri a la interfície líquid-aire.Les partícules de l'MP6, que eren més difícils de distingir que les de l'MP3-5, no arrossegaven quan l'imant es movia al llarg del capil·lar, però les cadenes MP es van dissociar, deixant les partícules a la vista (vegeu el vídeo suplementari S4: MP6).En alguns casos, quan el camp magnètic aplicat es va reduir movent l'imant a una llarga distància des del lloc d'imatge, els MP restants van baixar lentament a la superfície inferior del tub per gravetat, romanent a la corda (vegeu el vídeo suplementari S5: MP3). .
L'angle de la corda MP canvia a mesura que l'imant es mou cap a la dreta per sobre del capil·lar.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 i (d) MP6.El quadre vermell indica l'ampliació que millora el contrast.Tingueu en compte que els vídeos addicionals tenen finalitats informatives, ja que revelen una estructura de partícules important i informació dinàmica que no es pot visualitzar en aquestes imatges estàtiques.
Les nostres proves han demostrat que moure l'imant cap endavant i cap enrere lentament al llarg de la tràquea facilita la visualització de la MF en el context d'un moviment complex in vivo.No es van realitzar proves in vivo perquè les perles de poliestirè (MP1 i MP2) no eren visibles al capil·lar.Cadascun dels quatre MF restants es va provar in vivo amb l'eix llarg de l'imant col·locat sobre la tràquea en un angle d'uns 30 ° amb la vertical (vegeu les figures 2b i 3a), ja que això va donar lloc a cadenes MF més llargues i va ser més eficaç. que un imant..configuració finalitzada.No s'han trobat MP3, MP4 i MP6 a la tràquea de cap animal viu.Quan es visualitzava el tracte respiratori de les rates després de matar humanament els animals, les partícules es van mantenir invisibles fins i tot quan es va afegir volum addicional mitjançant una bomba de xeringa.MP5 tenia el contingut d'òxid de ferro més alt i era l'única partícula visible, per la qual cosa es va utilitzar per avaluar i caracteritzar el comportament de MP in vivo.
La col·locació de l'imant sobre la tràquea durant la inserció de MF va donar lloc a que molts, però no tots, es concentressin al camp de visió.L'entrada traqueal de partícules s'observa millor en animals sacrificats humanament.Figura 7 i vídeo suplementari S6: MP5 mostra una ràpida captura i alineació magnètica de partícules a la superfície de la tràquea ventral, cosa que indica que els MP es poden orientar a les zones desitjades de la tràquea.Quan es va cercar més distalment al llarg de la tràquea després del lliurament de MF, es van trobar alguns MF més a prop de la carina, cosa que indica una força del camp magnètic insuficient per recollir i contenir tots els MF, ja que es van lliurar a través de la regió de màxima força del camp magnètic durant l'administració de fluids.procés.Tanmateix, les concentracions de MP postnatals eren més altes al voltant de l'àrea de la imatge, cosa que suggereix que molts MP es van quedar a les regions de les vies respiratòries on la força del camp magnètic aplicat era més alta.
Imatges de (a) abans i (b) després del lliurament de MP5 a la tràquea d'una rata recentment sacrificada amb un imant col·locat just a sobre de l'àrea d'imatge.La zona representada es troba entre dos anells cartilaginosos.Hi ha una mica de líquid a les vies respiratòries abans de lliurar el MP.El quadre vermell indica l'ampliació que millora el contrast.Aquestes imatges estan extretes del vídeo que apareix a S6: Vídeo suplementari MP5.
Moure l'imant al llarg de la tràquea in vivo va provocar un canvi en l'angle de la cadena MP a la superfície de la via aèria, similar al que s'observa als capil·lars (vegeu la figura 8 i el vídeo suplementari S7: MP5).Tanmateix, en el nostre estudi, els MP no es podien arrossegar per la superfície de les vies respiratòries vives, com podrien fer els capil·lars.En alguns casos, la cadena MP s'allarga a mesura que l'imant es mou cap a l'esquerra i la dreta.Curiosament, també hem trobat que la cadena de partícules canvia la profunditat de la capa superficial del fluid quan l'imant es mou longitudinalment al llarg de la tràquea i s'expandeix quan l'imant es mou directament per sobre i la cadena de partícules es gira a una posició vertical (vegeu Vídeo suplementari S7).: MP5 a les 0:09, a la part inferior dreta).El patró de moviment característic va canviar quan l'imant es va moure lateralment per la part superior de la tràquea (és a dir, a l'esquerra o a la dreta de l'animal, més que al llarg de la tràquea).Les partícules encara eren clarament visibles durant el seu moviment, però quan es va treure l'imant de la tràquea, les puntes de les cordes de partícules es van fer visibles (vegeu el vídeo suplementari S8: MP5, a partir de les 0:08).Això concorda amb el comportament observat del camp magnètic sota l'acció d'un camp magnètic aplicat en un capil·lar de vidre.
Imatges de mostra que mostren MP5 a la tràquea d'una rata anestesiada viva.(a) L'imant s'utilitza per adquirir imatges a sobre i a l'esquerra de la tràquea, després (b) després de moure l'imant cap a la dreta.El quadre vermell indica l'ampliació que millora el contrast.Aquestes imatges són del vídeo que apareix al vídeo suplementari de S7: MP5.
Quan els dos pols estaven sintonitzats en una orientació nord-sud per sobre i per sota de la tràquea (és a dir, atreure; Fig. 3b), els acords MP semblaven més llargs i estaven situats a la paret lateral de la tràquea en lloc de a la superfície dorsal de la tràquea. tràquea (vegeu apèndix).Vídeo S9:MP5).No obstant això, no es van detectar concentracions elevades de partícules en un lloc (és a dir, la superfície dorsal de la tràquea) després de l'administració de fluids mitjançant un dispositiu de doble imant, que normalment es produeix amb un únic dispositiu d'imant.Aleshores, quan es va configurar un imant per repel·lir pols oposats (figura 3c), el nombre de partícules visibles al camp de visió no va augmentar després del lliurament.Configurar les dues configuracions d'imants és un repte a causa de l'alta força del camp magnètic que atrau o empeny els imants respectivament.A continuació, la configuració es va canviar a un únic imant paral·lel a les vies respiratòries, però que passava per les vies respiratòries en un angle de 90 graus, de manera que les línies de força travessen la paret traqueal ortogonalment (figura 3d), una orientació destinada a determinar la possibilitat d'agregació de partícules en la paret lateral.ser observat.Tanmateix, en aquesta configuració, no hi havia cap moviment d'acumulació de MF o moviment d'imants identificables.A partir de tots aquests resultats, es va triar una configuració amb un únic imant i una orientació de 30 graus per a estudis in vivo de portadors de gens (Fig. 3a).
Quan l'animal es va fotografiar diverses vegades immediatament després de ser sacrificat humanament, l'absència de moviment del teixit interferit va significar que es podien discernir línies de partícules més fines i curtes en el camp intercartilaginós clar, "oscil·lant" d'acord amb el moviment de translació de l'imant.veure clarament la presència i el moviment de partícules MP6.
El títol de LV-LacZ va ser d'1,8 x 108 UI/ml, i després de barrejar 1:1 amb CombiMag MP (MP6), els animals van ser injectats amb 50 µl d'una dosi traqueal de 9 x 107 UI/ml de vehicle LV (és a dir, 4,5 x 106 TU/rata).).).En aquests estudis, en comptes de moure l'imant durant el part, vam fixar l'imant en una posició per determinar si la transducció del ventril ventricular es podria (a) millorar en comparació amb el lliurament vectorial en absència de camp magnètic i (b) si la via aèria podria estar centrat.Les cèl·lules que s'estan transduint a les zones diana magnètiques del tracte respiratori superior.
La presència d'imants i l'ús de CombiMag en combinació amb vectors LV no semblava afectar negativament la salut animal, com ho va fer el nostre protocol estàndard de lliurament de vectors LV.Les imatges frontals de la regió traqueal sotmesa a pertorbacions mecàniques (figura suplementària 1) van mostrar que el grup tractat amb LV-MP tenia nivells de transducció significativament més alts en presència d'un imant (figura 9a).Només hi havia una petita quantitat de tinció blava de LacZ al grup control (figura 9b).La quantificació de les regions normalitzades tenyides de X-Gal va mostrar que l'administració de LV-MP en presència d'un camp magnètic va donar lloc a una millora d'aproximadament 6 vegades (Fig. 9c).
Exemple d'imatges compostes que mostren transducció traqueal amb LV-MP (a) en presència d'un camp magnètic i (b) en absència d'imant.(c) Millora estadísticament significativa de l'àrea normalitzada de transducció de LacZ a la tràquea amb l'ús d'un imant (*p = 0,029, prova t, n = 3 per grup, mitjana ± error estàndard de la mitjana).
Les seccions de color vermell ràpid neutres (exemple que es mostra a la figura suplementària 2) van indicar que les cèl·lules tenyides de LacZ estaven presents a la mateixa mostra i a la mateixa ubicació que es va informar anteriorment.
El repte clau de la teràpia gènica de les vies respiratòries segueix sent la localització precisa de partícules portadores a les àrees d'interès i l'assoliment d'un alt nivell d'eficiència de transducció al pulmó mòbil en presència de flux d'aire i eliminació activa del moc.Per als portadors de LV destinats al tractament de malalties respiratòries de la fibrosi quística, augmentar el temps de residència de les partícules portadores a les vies respiratòries conductores ha estat fins ara un objectiu inassolible.Tal com han assenyalat Castellani et al., l'ús de camps magnètics per millorar la transducció té avantatges sobre altres mètodes de lliurament de gens com l'electroporació perquè pot combinar simplicitat, economia, lliurament localitzat, eficiència més gran i temps d'incubació més curt.i possiblement una dosi més baixa de vehicle10.Tanmateix, la deposició i el comportament in vivo de partícules magnètiques a les vies respiratòries sota la influència de forces magnètiques externes mai s'han descrit, i de fet la capacitat d'aquest mètode per augmentar els nivells d'expressió gènica a les vies respiratòries vives intactes no s'ha demostrat in vivo.
Els nostres experiments in vitro amb el sincrotró PCXI van demostrar que totes les partícules que vam provar, a excepció del poliestirè MP, eren visibles a la configuració d'imatge que vam utilitzar.En presència d'un camp magnètic, els camps magnètics formen cordes, la longitud de les quals està relacionada amb el tipus de partícules i la força del camp magnètic (és a dir, la proximitat i el moviment de l'imant).Com es mostra a la figura 10, les cordes que observem es formen a mesura que cada partícula individual es magnetitza i indueix el seu propi camp magnètic local.Aquests camps separats fan que altres partícules similars es recullin i es connectin amb els moviments de cordes grupals a causa de les forces locals de les forces locals d'atracció i repulsió d'altres partícules.
Diagrama que mostra (a, b) cadenes de partícules que es formen dins dels capil·lars plens de líquid i (c, d) una tràquea plena d'aire.Tingueu en compte que els capil·lars i la tràquea no estan dibuixats a escala.El panell (a) també conté una descripció de la MF que conté partícules de Fe3O4 disposades en cadenes.
Quan l'imant es va moure sobre el capil·lar, l'angle de la corda de partícules va assolir el llindar crític per a MP3-5 que contenia Fe3O4, després del qual la cadena de partícules ja no es va mantenir a la seva posició original, sinó que es va moure al llarg de la superfície cap a una nova posició.imant.Aquest efecte probablement es produeix perquè la superfície del capil·lar de vidre és prou llisa per permetre que es produeixi aquest moviment.Curiosament, MP6 (CombiMag) no es va comportar d'aquesta manera, potser perquè les partícules eren més petites, tenien un recobriment o càrrega superficial diferent, o el fluid portador propietari va afectar la seva capacitat de moviment.El contrast a la imatge de partícules CombiMag també és més feble, cosa que suggereix que el líquid i les partícules poden tenir la mateixa densitat i, per tant, no es poden moure fàcilment les unes a les altres.Les partícules també es poden enganxar si l'imant es mou massa ràpid, cosa que indica que la força del camp magnètic no sempre pot superar la fricció entre les partícules del fluid, cosa que suggereix que la força del camp magnètic i la distància entre l'imant i l'àrea objectiu no haurien de ser sorpresa.important.Aquests resultats també indiquen que, tot i que els imants poden capturar moltes micropartícules que flueixen per la zona objectiu, és poc probable que es pugui confiar en els imants per moure partícules CombiMag al llarg de la superfície de la tràquea.Així, vam concloure que els estudis LV MF in vivo haurien d'utilitzar camps magnètics estàtics per orientar-se físicament a àrees específiques de l'arbre de les vies respiratòries.
Una vegada que les partícules s'entreguen al cos, són difícils d'identificar en el context del complex teixit en moviment del cos, però la seva capacitat de detecció s'ha millorat movent l'imant horitzontalment sobre la tràquea per "menejar" les cordes MP.Tot i que la imatge en temps real és possible, és més fàcil discernir el moviment de les partícules després que l'animal hagi estat assassinat humanament.Les concentracions de MP solen ser més altes en aquest lloc quan l'imant es col·locava sobre l'àrea d'imatge, tot i que algunes partícules normalment es trobaven més avall de la tràquea.A diferència dels estudis in vitro, les partícules no es poden arrossegar per la tràquea pel moviment d'un imant.Aquesta troballa és coherent amb com la mucositat que cobreix la superfície de la tràquea processa normalment les partícules inhalades, atrapant-les a la mucositat i, posteriorment, netejant-les mitjançant el mecanisme d'eliminació mucociliar.
Vam plantejar la hipòtesi que l'ús d'imants per sobre i per sota de la tràquea per a l'atracció (Fig. 3b) podria donar lloc a un camp magnètic més uniforme, en lloc d'un camp magnètic molt concentrat en un punt, que podria donar lloc a una distribució més uniforme de partícules..Tanmateix, el nostre estudi preliminar no va trobar proves clares que recolzin aquesta hipòtesi.De la mateixa manera, establir un parell d'imants per repel·lir-se (Fig. 3c) no va provocar que s'assentís més partícules a la zona de la imatge.Aquestes dues troballes demostren que la configuració de doble imant no millora significativament el control local de l'apunt de MP i que les fortes forces magnètiques resultants són difícils d'ajustar, fent que aquest enfocament sigui menys pràctic.De la mateixa manera, l'orientació de l'imant per sobre i a través de la tràquea (figura 3d) tampoc va augmentar el nombre de partícules que quedaven a la zona de la imatge.Algunes d'aquestes configuracions alternatives poden no tenir èxit, ja que donen lloc a una reducció de la força del camp magnètic a la zona de deposició.Així, la configuració d'un imant únic a 30 graus (Fig. 3a) es considera el mètode de prova in vivo més senzill i eficient.
L'estudi LV-MP va demostrar que quan els vectors LV es van combinar amb CombiMag i es van lliurar després de ser alterats físicament en presència d'un camp magnètic, els nivells de transducció van augmentar significativament a la tràquea en comparació amb els controls.A partir d'estudis d'imatge de sincrotró i resultats de LacZ, el camp magnètic semblava poder mantenir el LV a la tràquea i reduir el nombre de partícules vectorials que immediatament van penetrar profundament al pulmó.Aquestes millores d'orientació poden conduir a una major eficiència alhora que redueixen els títols lliurats, la transducció no dirigida, els efectes secundaris inflamatoris i immunitaris i els costos de transferència de gens.És important destacar que, segons el fabricant, CombiMag es pot utilitzar en combinació amb altres mètodes de transferència de gens, inclosos altres vectors virals (com ara AAV) i àcids nucleics.